Systematische Quantifizierung des mitochondrialen Imports von Präproteinen unter proteotoxischen Bedingungen

Abstract

Die Analyse von Mitochondrien ist ein wichtiger Indikator für den Gesundheitszustand einer Zelle und es wurde in den letzten Jahren immer deutlicher, dass die Untersuchung der Mitochondrien in vielen Krankheiten immer mehr Relevanz erhält. Ein Indikator für funktionierende Mitochondrien ist der mitochondriale Import und die damit verbundene Importkinetik. Es war bisher nicht möglich, exakte Messungen der Importgeschwindigkeit mithilfe von Präproteinen durchzuführen, da die Methodiken wie radioaktiver Import oder Antikörperdetektion technisch viele Nachteile aufweisen. Fluoreszenzmarkierte Präproteine wie Su9-DHFR-Cys-Strep-His (SDCSH) hingegen können dabei helfen, die Importgeschwindigkeit <em>in vitro</em> zu messen. In dieser Doktorarbeit wurden der Import mit SDCSH, sowie die Expression, Rückfaltung, Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff und Auswertung der Importdaten etabliert und bei Mitochondrien der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und verschiedenen Säugetierzelllinien durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der Import in Mitochondrien der Bäckerhefe viel schneller abläuft, als es bei den Mitochondrien aus den Säugetierzelllinien der Fall ist. Der Import bei Mitochondrien aus HeLa besitzt ein Temperaturoptimum bei 37 °C, während für Hefe 25 °C die optimale Temperatur waren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Import durch Erhöhung der Temperatur eine Temperaturabhängigkeit aufweist. Der Einfluss von oxidativem Stress (Reaktive Sauerstoffspezies) zeigte bei HeLa-Mitochondrien eine Reduzierung des Imports mit gleichzeitiger Depolarisation des Membranpotentials. Im Zuge von ROS-Experimenten mit der Hefe-Mutante <em>sod2Δ</em> im Vergleich zum Wildtyp wurde der Import mithilfe von SDCSH analysiert und es konnte kein Unterschied in der Importkinetik aufgezeigt werden. In weiteren Experimenten wurden amyloide Aggregate (DiAβ, Aβ40, Aβ42), sowie das hydrophobe Proteinsegment von α-Synucleins mit den Aminosäuren 61 bis 95 eingesetzt, um den Effekt der Aggregate, welche in dem Kontext der neurodegenerativen Krankheiten Alzheimer und Parkinson auftreten, auf den mitochondrialen Import zu analysieren. Das Beta-Amyloid DiAβ, welches aus zwei Aβ40 besteht, zeigte eindeutig eine Hemmung des Imports. Die amyloiden Monomere von Aβ40 und Aβ42 zeigten auch eine Hemmung des Imports, wobei diese aber schwächer ausfiel als bei DiAβ. Die Experimente mit α-Synuclein (61-95) zeigten keinen Effekt auf den Import, sowie auf Membranpotential oder mitochondriale Integrität. Außerdem wurde der Effekt von isoliertem Zytosol und sich darin befindenden Chaperonen auf den mitochondrialen Import getestet, welcher zu einer ATP-abhängigen Hemmung des Imports und zur Reduzierung des Imports führte. Zytosol konnte bei Zugabe zu amyloiden Aggregaten den Import nicht wiederherstellen, was in einem noch langsameren Import resultierte. <br/> Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Messung der Importkinetik unter Verwendung eines rekombinanten fluoreszenzmarkierten Präproteins etabliert werden konnte und eine Analyse des Einflusses verschiedener Bedingungen auf den mitochondrialen Import <em>in vitro</em> überprüft wurde.