Deep Phenotyping of disease resistance based on hyperspectral imaging and data mining methods in high throughput

Abstract

Hyperspectral imaging for plant phenotyping has become an established research method using the visible to short wave infrared range (400-2500 nm). This allows for the differentiation, identification, and quantification of foliar diseases by linking spectral reflectance changes to different substances and processes within leaves. Although a wide range of secondary plant metabolites is involved in susceptible and resistant plant-pathogen interactions, their influence on the spectral reflectance has not yet been studied as they feature their absorption maxima in the ultraviolet range (UV; 100-380 nm). <br /> This study aimed to implement a new hyperspectral imaging set-up in the UV-range to investigate different plant-pathogen interactions and characterise them by changes of secondary plant metabolites. For this purpose, measurement protocols, as well as evaluation routines, were established. Due to the harmful influence of UV-light on plant tissue, the measurement conditions were studied and set accordingly. Thus, it could be ensured that spectral changes were not induced by the UV-light source but by plant-pathogen interactions. The new measurement system was compared to an established non-imaging system by measuring several reference substances, where the imaging sensor produced comparable data with an additional spatial resolution. Following, plant-pathogen interactions of susceptible and resistant barley genotypes (Hordeum vulgare) inoculated with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei) were investigated, and it was possible to distinguish different interactions by spectral changes. The in parallel extracted and analysed pigments and flavonoids were checked for correlation with the recorded spectral changes. In addition, hyperspectral imaging in the UV-range allowed for the differentiation of two foliar diseases of sugar beet (Cercospora leaf spot and sugar beet rust)by linking spectral changes to changes of secondary plant metabolites, which were quantified by destructive high-pressure liquid chromatography and extraction procedures. A subsequent analysis of the recorded spectral data with deep learning algorithms allowed for the differentiation between diseases and between symptom classes. However, the use of deep neural networks to accelerate the analysis of complex hyperspectral imaging data has to be examined critically to avoid the use of confounding factors to achieve high classification results. This was evident in the classification of an extensive high-throughput data set within this work, where elements of the image background were used instead of the plant samples for classification purposes. <br /> The results of this thesis highlight that hyperspectral measurements in the UV-range can be used to study different plant-pathogen interactions and therefore allow for estimations about changes in the plant’s metabolism. Parallel extraction and analysis of secondary plant metabolites and pigments enabled a connection between spectral changes and metabolite changes, verifying the potential of hyperspectral measurements in the UV-range for plant phenotyping. The interaction of the sensor and UV-illumination remains challenging as significant peaks were recorded in all measurements, which cannot be considered for the interpretation of plant-pathogen interactions. While deep learning algorithms permit the detection and identification of plant diseases, they must be critically examined to exclude confounding factors. However, hyperspectral measurements in the UV-range can already be used to distinguish between plant-pathogen interactions and further investigate the influence of foliar diseases on plant physiology and biochemistry.

Die Phänotypisierung von Pflanzen mit Hilfe hyperspektraler Bildgebung fokussierte sich bisher auf die Spektralbereiche des sichtbaren Lichts bis kurzwelligen Infrarot (400-2500 nm). In diesen Bereichen deuten Änderungen der spektralen Reflektanz auf verschiedenen Substanzen und Prozessen innerhalb der Blätter hin. Das ermöglicht die Differenzierung, Identifizierung und Quantifizierung von Blattkrankheiten. Obwohl ein breites Spektrum von sekundären Pflanzenmetaboliten an den Wechselwirkungen zwischen anfälligen und resistenten Pflanzen und Krank-heitserregern beteiligt ist, wurde ihr Einfluss auf die spektrale Reflexion noch nicht untersucht, da das Absorptionsmaximum von sekundäre Pflanzenstoffen im ultravioletten Bereich (UV; 100-380 nm) liegt. <br /> Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines neuen bildgebenden hyperspektralen Messaufbaus im UV-Bereich, um verschiedene Pflanze-Pathogen-Interaktionen durch Veränderungen von sekundären Pflanzenstoffen zu charakterisieren. Dazu wurden Messprotokolle sowie Auswerte-routinen entwickelt. Der schädliche Einfluss von UV-Licht auf Pflanzengewebe wurde untersucht und es wurden Messbedingungen definiert, die nicht zu einer Schädigung des Pflanzengewebes führen. Damit konnte sichergestellt werden, dass die spektralen Veränderungen nicht durch die UV-Lichtquelle, sondern durch Wechselwirkungen zwischen Pflanze und Pathogen hervorgerufen werden. Zur Evaluierung der Messgenauigkeit und -qualität wurden vergleichende Messungen mit dem UV-Messaufbau und einem nicht-bildgebenden Spektroradiometer von standartisierten Substanzen durchgeführt. So konnte eine hohe Messgenauigkeit des bildgebenden Messaufbaus bei zusätzlicher räumlicher Auflösung demonstriert werden. Die Untersuchung von anfälligen und resistenten Gerstengenotypen (Hordeum vulgare) inokuliert mit Echtem Mehltau (Blumeria graminis f.sp. hordei) zeigte, dass eine Differenzierung der verschiedenen Interaktionen durch spektrale Veränderungen möglich ist. Die extrahierten und analysierten Pigmente und Flavonoide wurden mit den spektralen Veränderungen verglichen. Hyperspektrale Messungen im UV-Bereich ermöglichten auch die Differenzierung von zwei Blattkrankheiten der Zuckerrübe (Cercospora-Blattflecken und Zuckerrübenrost). Dazu wurden die spektralen Veränderungen mit den Veränderungen der sekundären Pflanzenstoffe in Verbindung gebracht, die durch destruktive Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Extraktionsverfahren quantifiziert wurden. Die Untersuchung der hyperspektralen Daten mit Deep-Learning-Algorithmen durch Klassifizierungen ermöglichte nicht nur die Unterscheidung zwischen den zwei Blattkrankheiten der Zuckerrübe, sondern auch zwischen Symptomklassen der Blattkrankheiten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein umfangreicher Hochdurchsatz-Datzensatz von Zuckerrübenblättern, inokuliert mit Cercospora Blattflecken, untersucht. Die Klassifizierung mit Deep-Learning-Algorithmen war erflogreich. Bei genaueren Analysen zeigte sich, dass Elemente des Bildhintergrunds anstelle der Pflanzenproben für die Klassifizierung verwendet wurden. Um zu vermeiden, dass solche Störfaktoren zur Erzielung hoher Klassifikationsergebnisse verwendet werden, muss der Einsatz von tiefen neuronalen Netzen zur Beschleunigung der Analyse komplexer Datensätze kritisch hinterfragt werden. <br /> Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hyperspektrale Messungen im UV-Bereich zur Charakterisierung verschiedener Pflanzen-Pathogen-Interaktionen genutzt werden können und der Einfluss von Blattkrankheiten auf den pflanzlichen Stoffwechsel durch die Überwachung von Stress-prozessen in Pflanzen identifiziert werden kann. Die Extraktion und Analyse von sekundären Pflanzenstoffen und Pigmenten ermöglichte den Vergleich zwischen spektralen Veränderungen und Veränderungen der Metaboliten. Damit wurde das Potenzial von hyperspektralen Messungen im UV-Bereich für die Phänotypisierung von Pflanzen bestätigt. Eine Herausforderung sind ausgeprägten Peaks, die bei allen Messungen aufgezeichnet wurden und durch das UV-Licht an bestimmen Wellenlängen entstehen. Diese Wellenlängen dürfen bei der Interpretation von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen nicht berücksichtigt werden können. Mit Hilfe von hyperspektralen Messungen im UV-Bereich kann bereits jetzt zwischen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen unterschieden werden und der Einfluss von Blattkrankheiten auf die Pflanzenphysiologie und Pflanzenbiochemie dargestellt werden.