Charakterisierung der Neddylierung von Cofilin1

Abstract

Nachdem lange davon ausgegangen wurde, dass die posttranslationale Modifikation durch Nedd8 nur bestimmte Culline und den Zellzyklus reguliert, sind in den vergangenen Jahren weitere neddylierte Proteine gefunden worden, die nicht im Zusammenhang mit dem Zellzyklus stehen, sondern andere Funktionen in der Zelle wahrnehmen. Anknüpfend daran habe ich in dieser Arbeit einen Pulldown entwickelt und eine Mauslinie mit getaggtem Nedd8 generiert, um gewebespezifisch die Neddylome der Maus zu bestimmen. <br /> Mir ist es gelungen einen Pulldown zu entwickeln, der es sowohl ermöglicht in heterologen Systemen exprimierte Proteine, sowie davon abgeleitete Mutanten auf Neddylierung zu untersuchen, als auch bei endogen exprimierten Proteinen in einem unvoreingenommenen Experiment zu bestimmen, ob sie neddyliert werden. Hierbei werden stringente und denaturierende Waschbedingungen benutzt. Die Neddylierung in der Maus findet in vivo und unter endogenen Expressionsleveln statt. Die Verifizierung, dass die Neddylierung über die Neddylierungsmaschinerie erfolgt, wird durch Verwendung des NAE1-Inhibitors MLN-4924 in der Zellkultur oder in der Maus über das Einkreuzen von einer Mauslinie mit gefloxtem NAE1 erreicht. <br /> Weitergehend habe ich auf der Suche nach dem neddylierten Protein, das für das filopodienartige Aussehen von den Spines in der Zellkultur nach der Neddylierungsinhibition durch MLN-4924 verantwortlich ist, Cofilin1 als ein neddyliertes Protein identifiziert. Ich habe die neddylierten Lysine von Cofilin1 bestimmt. Darauf folgend habe ich eine neddylierungsdefiziente Cofilin1-Mutante erzeugt und den Einfluss auf die neuronale Entwicklung in der Maus untersucht. Vermutlich wird das Neuritenwachstum durch die Neddylierung von Cofilin1 initiiert. <br /> Zuletzt postuliere ich anhand von in silico Modellierungsdaten eine potentielle Bindestelle für UBC12 auf den neddylierten Proteinen. Diese Bindestelle ist keine lineare Sequenz, die sich an der Primärstruktur erkennen lässt, sondern vielmehr eine dreidimensionale Erkennungsoberfläche, die durch die Tertiärstruktur des Proteins ausgebildet wird.