Liyanage, Vidura Lawrance: Die humane RNA-Helikase DDX19 : Identifizierung ihres Kernimportsignals und Analyse ihrer Rolle beim Export von mRNA. - Bonn, 2023. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-69474
@phdthesis{handle:20.500.11811/10592,
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author = {{Vidura Lawrance Liyanage}},
title = {Die humane RNA-Helikase DDX19 : Identifizierung ihres Kernimportsignals und Analyse ihrer Rolle beim Export von mRNA},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2023,
month = jan,

note = {Der mRNP-Export durch DDX19
Der nukleare Export von mRNPs (messenger-Ribonukleoproteine) wird in menschlichen Zellen durch die RNA-Helikase DDX19, zusammen mit dem Nukleoporin NUP214 und dem Exportfaktor Gle1 vermittelt. Durch frühere biochemische und genetische Experimente und durch die Aufklärung der molekularen Strukturen der an diesem Prozess beteiligten Proteinen und Kofaktoren konnte dieser Mechanismus bereits zu einem Großteil entschlüsselt werden. Bislang fehlten jedoch Daten zu der in vivo Kinetik lebender menschlicher Zellen. Um also die bestehenden Studien zu diesem Prozess zu ergänzen und zu vervollständigen, wurde im Folgenden eine detaillierte Analyse des DDX19-vermittelten mRNP Exports in menschlichen HeLa-Zellen in vivo unter Verwendung der Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie auf Einzelmolekülebene durchgeführt. Auf diese Weise konnten zwei Aspekte des Prozesses aufgeklärt werden.
Als Erstes konnte die zugrundeliegende Kinetik des mRNP-Exports beobachtet werden. Zu diesem Zweck wurde eine stabile Zelllinie erzeugt, die das induzierbare Fusionsprotein bestehend aus DDX19 mit dem sogenannten HaloTag exprimiert, das die Visualisierung einzelner DDX19-Moleküle in HeLa-Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wurde eine Zelllinie erzeugt, die das Fusionsprotein bestehend aus hnRNP A1 mit dem sogenannten SnapTag exprimiert. hnRNP A1 ist ein Ribonukleoprotein, das in der frühen Phase der RNP-Biogenese an mRNPs bindet und diese während ihrer Translokation durch die Kernporenkomplexe (NPCs) ins Zytoplasma begleitet. Die gleichzeitige Visualisierung der NPCs durch das Fusionsprotein, welches aus dem spezifischen Importfaktor NTF2 und dem fluoreszierenden Protein eGFP besteht, ermöglichte die Einzelmolekülanalyse der Bindungszeiten von DDX19-HaloTag und hnRNP A1-SnapTag-gebundenen mRNPs mit den NPCs. Dabei betrug die Bindungszeit von DDX19-HaloTag Proteinen an den NPCs ca. 45 ms und die von hnRNP A1-SnapTag-gebundenen mRNPs ca. 36 ms.
Als Zweites konnte der Reaktionsablauf zwischen DDX19, mRNP, Gle1 und NUP214 beim mRNP-Export entschlüsselt und ein Reaktionszyklus für DDX19 auf der Grundlage der durchgeführten in vivo-Messungen festgelegt werden. Zu diesem Zweck mussten drei zusätzliche Zelllinien erzeugt werden, die jeweils eine mutierte DDX19-Variante induzierbar exprimierten. Die erste war die K385E-Mutante, die defizient in der Gle1-Bindung ist. Die zweite war die D223R-Mutante, die defizient in der NUP214 und mRNP-Bindung ist und die dritte war die E243Q-Mutante, die nicht in der Lage ist, ATP zu hydrolysieren. Die gleichzeitige Visualisierung von eGFP-NTF2 ermöglichte auch in diesen Zellen die Bestimmung der Bindungszeiten mit den Kernporen.
Durch den Vergleich der Bindungszeiten und Bindungshäufigkeiten zwischen dem Wildtyp-Protein und den drei Mutanten konnte der Reaktionszyklus für den DDX19-vermittelten mRNP-Export aufgestellt werden. In diesem bindet DDX19 im ersten Schritt an das NUP214 und wird so auf der zytoplasmatischen Seite der Kernpore lokalisiert. Darüber hinaus führt die Bindung zu NUP214 zu einer erhöhten Affinität von DDX19 zu Gle1. Die darauffolgende Bindung an das Gle1 führt wiederum zu einer erhöhten Affinität von DDX19 zu mRNP, was zur Bindung an mRNP führt. Die anschließende ATP-Hydrolyse führt zur Entfernung der Exportfaktoren vom mRNP und der Freigabe in das Zytoplasma.
Die NLS des DDX19
Moleküle mit einem Durchmesser ~5 nm oder einer Masse ~30 kDa benötigen Transportfaktoren, um das hydrophobe Innere der NPCs zu passieren. Die Bindungsstellen auf den Molekülen, die die Transportfaktoren binden, werden als Kernlokalisierungs- (NLS) bzw. Kernexportsignale (NES) bezeichnet. In dieser Arbeit konnte eine basenreiche Sequenz auf der C-terminalen Seite von DDX19 (425HRIGRTGRFGKR436) als potenzielle NLS identifiziert werden.},

url = {https://hdl.handle.net/20.500.11811/10592}
}

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