Biochemische Analyse der Interaktion von P2X4 und P2X7 und Charakterisierung von P2X7B und genetisch verlinkten P2X4/P2X7-Konkatameren

Abstract

Das übergeordnete Ziel meiner Arbeit war die Untersuchung der Interaktion von P2X7 und P2X4. Zur Identifikation von potenziellen Interaktionspartnern habe ich den P2X7-Rezeptors von Mensch und Ratten mit den weiteren P2X-Isoformen koexprimiert und nach dem Köder-und Beute-System proteinchemisch analysiert. Eine Heterotrimerisierung von hP2X7 und hP2X4 konnte ich durch Koexpression der C-terminal trunkierten hP2X7-Untereinheit (hP2X71-408 bzw. hP2X71-436) mit der hP2X4-Untereinheit nachweisen. Die Ergebnisse deuten somit daraufhin, dass die hP2X7A-Untereinheit ebenso mit der hP2X4-Untereinheit zu einem Heterotrimer assemblieren würde, da die entscheidende Assemblierungsdomäne in der Ektodomäne liegt. <br /> Zur Erstellung der homomeren und heteromeren Konkatamere wurden die rP2X4- und rP2X7-Untereinheiten in definierter Zusammensetzung aneinander ligiert. Es wurde biochemisch mittels SDS-PAGE untersucht, welchen Einfluss die Linker, die Anordnung der Untereinheiten und die Protease-Inhibitoren auf die Expression der Konkatamere haben. Die Untersuchung zeigte, dass lange Linker für eine starke Expression und kurze Linker für eine verringerte Erzeugung von Abbau-Produkten am besten geeignet sind. <br /> Ein letztes Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der desensibilisierenden Spleißvariante hP2X7B. Die unterschiedliche Kinetik und der Einfluss der Länge der C-terminalen Endodomäne auf die Kinetik-Eigenschaften der beiden hP2X7-Varianten wurde dargestellt. Um einen direkten Vergleich zu erzielen wurde die C-terminale Endodomäne der hP2X7A-Untereinheit um die abweichende Aminosäuresequenz gekürzt und die unterschiedliche Expression der beiden hP2X7-Varianten biochemisch mittels SDS-PAGE und BN-PAGE sowie elektrophysiologisch mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme charakterisiert. Die Desensibilisierung der hP2X7B-Untereinheit bei der ersten ATP-Applikation spricht für die Bildung der zytoplasmatischen Kappe, trotz einer C-terminalen Endodomäne bestehend aus neun Aminosäuren. <br /> Zusammengenommen wurde die Heteromerisierung der beiden Untereinheiten P2X4 und P2X7 biochemisch nachgewiesen und homomere P2X4- und P2X7-Konkatamere sowie P2X7B biochemisch verifiziert.