Einfluss der Cyclin-abhängigen Kinase 5 auf die Expression des Programmed Cell Death Ligand 1 in murinen Pankreaskarzinomen im Vergleich verschiedener Analysemethoden

Abstract

<strong>Einleitung:</strong> Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) ist ein immuninhibitorisches Molekül, das für gewöhnlich von bestimmten Immunzellen oder dendritischen Zellen exprimiert wird. Auch verschiedene Tumoren exprimieren PD-L1, wodurch sie die antitumorale Immunabwehr unterwandern. Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5) bildet eine atypische Cyclin-abhängige Kinase mit wichtigen Funktionen in Zellmigration und neuronaler Entwicklung. Dorand et al. (2016) wiesen eine CDK5-abhängige IFN-γ-vermittelte PD-L1-Hochregulation im Medulloblastom-Mausmodell nach. Dieser Mechanismus ist offenbar nicht Medulloblastom-spezifisch, da auch andere Tumoren und Zelltypen eine positive Korrelation von CDK5- und PD-L1-Expression zeigten. <br /> <strong>Methoden:</strong> Zur Evaluation von CDK5- und PD-L1-Expression kultivierten wir 7 verschiedene humane Zelllinien pankreatischer duktaler Adenokarzinome (PDAC) und generierten transgene Mauslinien der Genotypen LSL-Kras^G12D; LSL-Trp53^R172H; PDX1-Cre (KPC, CDK5 WT; n=18) sowie LSL-Kras^G12D; LSL-Trp53^R172H; PDX1-Cre; CDK5^flox/flox (KPCC, CDK5 fl/fl; n=22), welche PDACs entwickelten. Mittels Western Blot erfolgte die Expressionsanalyse von CDK5 und PD-L1 in den PDAC-Zelllinien. Zur Analyse von CDK5- und PD-L1-Expression in vivo entnahmen wir das Pankreas der Mäuse und nutzten DAB-basierte Immunhistochemie zur Färbung der Präparate. In den Präparaten suchten wir die Bereiche mit der stärksten sowie schwächsten PD-L1-Intensität sowie 4 weitere zufällige Bereiche auf. Danach suchten wir die exakt korrespondierenden Regionen in den CDK5-Färbungen auf. <br /> <strong>Ergebnisse:</strong> Es zeigten sich statistisch signifikante Expressionsunterschiede zwischen den Mauspopulationen (KPC und KPCC) für CDK5 sowie für PD-L1 in der Immunhistochemie. Eine gesteigerte CDK5-Expression in der KPC-Mauspopulation (CDK5 WT) (84,40% vs. 13,07%, p<0,0001) war assoziiert mit höherer PD-L1-Expression verglichen mit der KPCC-Mauspopulation (CDK5 fl/fl) (83,56% vs. 51,96%, p<0,0001). Neben des höheren Prozentsatzes positiver Zellen für CDK5 und PD-L1 in der KPC-Gruppe zeigte sich zugleich auch eine stärkere Färbeintensität für beide Moleküle in dieser Gruppe. Desweiteren zeigte auch eine Expressionsanalyse mit dem Programm IHC Profiler statistisch signifikante Unterschiede zwischen beiden Gruppen. <br /> <strong>Diskussion:</strong> Die vorliegenden Daten stützen die Annahme, dass auch in PDACs eine höhere CDK5-Expression mit einer höheren und stärkeren Expression von PD-L1 einhergeht. Folglich kommen gegen PD-L1 bzw. dessen Rezeptor Programmed Cell Death Protein 1 (PD1) gerichtete Inhibitoren ebenso wie Inhibitoren des CDK5-Signalweges beim PDAC im Kontext einer Immuncheckpointtherapie als potentielle Therapeutika in Betracht.

<strong>Influence of the Cyclin-Dependent Kinase 5 on the expression of Programmed Cell Death Ligand 1 in murine Pancreatic Carcinomas in comparison of different methods of analysis</strong><br /> <strong>Introduction:</strong> Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) is an immune inhibitory molecule that usually is expressed by certain immune cells or dendritic cells. Also different tumor entities are expressing PD-L1, thus avoiding immune defense mechanisms. Cyclin dependent kinase 5 (CDK5) represents an atypical Cyclin dependent kinase, which has important functions in cell migration and neuronal development. Dorand et al. (2016) showed a CDK5-dependent IFN-γ-mediated PD-L1-upregulation in a Medulloblastoma mouse model. There are hints that this interaction is not just specific for Medulloblastomas. Also other tumors or cell types showed a positive correlation in CDK5 and PD-L1 expression. <br /> <strong>Methods:</strong> For evaluation of CDK5 and PD-L1 expression we cultured 7 different human cell lines of Pancreatic Ductal Adenocarcinomas (PDAC) and generated transgenic mouse lines with the genotypes LSL-Kras^G12D; LSL-Trp53^R172H; PDX1-Cre (KPC, CDK5 WT; n=18) and LSL-Kras^G12D; LSL-Trp53^R172H; PDX1-Cre; CDK5^flox/flox (KPCC, CDK5 fl/fl; n=22), which developed PDACs due to their genetic mutations. We used Western Blot to compare the expression profiles of CDK5 and PD-L1 in the PDAC cell lines. To compare CDK5 and PD-L1 expression pattern in vivo we extracted the pancreas of the mice and used DAB-based immunohistochemistry (IHC) to stain the specimens. Then we searched for the areas in the specimens with the strongest and the lightest PD-L1 intensity, as well as for 4 random areas. In a second step we searched for the exactly corresponding regions in the slides stained for CDK5. <br /> <strong>Results:</strong> We found statistically significant different expression patterns between both mouse populations (KPC and KPCC) for CDK5 and also for PD-L1 using IHC. An increased CDK5 expression in the KPC mouse population (CDK5 WT) (84,40% vs. 13,07%, p<0,0001) was associated with a higher PD-L1 expression compared to the KPCC mice (CDK5 fl/fl) (83,56% vs. 51,96%, p<0,0001). Apart from higher percentages of positive cells for CDK5 and PD-L1 in the KPC group we could also demonstrate a stronger staining intensity in this group for both molecules. Further calculating the cell percentages stained with the program IHC Profiler also showed statistical significant differences between both groups. <br /> <strong>Discussion:</strong> The present data supports the assumption that also in PDACs higher CDK5 expression is associated with a higher and stronger expression of PD-L1. Thus PD-L1 inhibitors or inhibitors of its receptor Programmed Cell Death Protein 1 (PD1) as well as inhibitors of the CDK5 pathway could be a potential treatment in PDAC in the context of immune checkpoint therapy.