Untersuchung der Steuerung der Expression des humanen P2Y₁₂-Rezeptors mittels Mutagenese

Abstract

Der humane (h) P2Y₁₂-Rezeptor ist ein Gi-Protein-gekoppelter-Rezeptor, der zu einer der bedeutendsten Proteingruppen des menschlichen Organismus gehört und über die Inhibition der Adenylatzyklase und Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels weitere Signalkaskaden auslöst. Der hP2Y₁₂-Rezeptor spielt zusammen mit dem P2Y₁-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der ADP-induzierten Thrombozytenaggregation. hP2Y₁₂- Rezeptoren finden sich aber beispielsweise auch im zentralen Nervensystem auf Mikrogliazellen. Daten von Patienten mit Mutationen im hP2Y₁₂-Rezeptorprotein haben wesentlich zum Verständnis der Funktion verschiedener Rezeptorbestandteile beigetragen. Nisar et al. beschrieben 2011 einen Patienten mit einer Mutation innerhalb der PDZ-Domäne des terminalen C-Terminus des hP2Y₁₂-Rezeptor, genauer Ersatz des Prolins durch Alanin an Aminosäure 341 (P341A), der klinisch eine milde Blutungsneigung zeigte. Eine PDZ-Domäne besteht aus vier Aminosäuren, ETPM (Glutaminsäure, Threonin, Prolin, Methionin), die eine definierte Proteinregion am C-Terminus bilden, der spezifische Funktionen zur Signalvermittlung, Rezeptortransport und Endozytose, sowie Rezeptorrecycling zukommen (Marchese et al., 2008). Nisar et al. beschrieben 2011 in ihrer Arbeit, dass die Mutation innerhalb der PDZ-Domäne vor allem die quantitative Expression des Rezeptors an der Zellmembran durch vermindertes Arrestin-abhängiges Recycling nach Agonistenbindung beeinflusst (Nisar et al., 2011). <br /> Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, den C-Terminus des Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese zu verändern, und die so erzeugten Konstrukte anhand ihrer Expression zu untersuchen, um so Rückschlüsse auf die Relevanz und Funktion einzelner Abschnitte und Aminosäuren des C-Terminus ziehen zu können. <br /> Sowohl bei Deletion des Großteils des C-Terminus (del321_342), Deletion lediglich der PDZ-Domäne, Verdopplung der PDZ-Domäne, als auch Ersatz des Prolins innerhalb der PDZ-Domäne durch Alanin (P341A) kam es nach Ligation an einen mit Fluoreszenzfarbstoff gebunden Vektor und anschließender Transfektion in CHO-Zellen zu einer Expression des Rezeptors. Die Expression war in allen Mutanten in der Regel unverändert primär membranständig vorhanden. Als einzige Ausnahme konnte die stabile Zelllinie mit der Mutation del321_342 identifiziert werden, bei der die membranständige 94 Expression aufgehoben war und der Rezeptor primär diffus intrazellulär vorlag. Möglicherweise liegt die Ursache in einem gestörten Rezeptorrecycling, für das auch weiter proximal gelegene Anteile des C-Terminus notwendig sind. <br /> Weiterhin war die membranständige Expression aller Rezeptorvarianten aufgehoben, bei denen eine N-terminale Modifikation durch Bindung an ein fluoreszentes Protein vorgenommen wurde. Möglicherweise ist hierdurch der Rezeptortransport oder Einbau in die Zellmembran gestört, weswegen der Rezeptor intrazellulär verweilt. Weitere Untersuchungen, z.B. Mutagenesestudien am N-Terminus sind notwendig, um die molekularen Ursachen genauer zu erforschen.