Untersuchungen zur Hemmung der Ectonucleotidase NPP1 auf Tumorzellen durch Heparinderivate und deren Konsequenzen für eine Deregulierung der antitumoralen Immunreaktion

Abstract

Die ubiquitär exprimierte Enzymklasse der Ektonukleotidasen (EN) reguliert die purinerge Signaltransduktion über die Purinderivate Adenosin und ATP. Dabei erfolgt die Darstellung von Adenosin aus ATP unter anderem durch eine zweistufige Enzymkaskade bestehend aus NPP1 und CD73. NPP1 katalysiert die initiale Abspaltung von Pyrophosphat, wonach CD73 im zweiten Schritt das Intermediat AMP zu Adenosin umwandelt. Neben der Steuerung zahlreicher Prozesse im Organismus regulieren ATP und Adenosin ebenfalls die Aktivität des Immunsystems. Dabei greift ATP proinflammatorisch und Adenosin immunregulativ ein. Insbesondere in soliden Tumoren führt die Deregulation der EN-Aktivität zu einem Ungleichgewicht in der Purinhomöostase durch lokale Akkumulation immunsuppressiven Adenosins. In der Folge entzieht sich der Tumor dem Zugriff des Immunsystems. Aufgrund dessen wird an Antikörpern und Inhibitoren gegen die immunsuppressive Aktivität der EN geforscht. Während sich einige Studien bereits CD73 gewidmet haben, ist NPP1 weniger gut erforscht. Das Ziel dieser Arbeit war es, Inhibitoren für NPP1 zu identifizieren und deren immunonkologische Auswirkungen auf in-vitro-Modelle zu evaluieren. <br /> Anhand der Glioblastomzelllinie U87 wurde mittels Kapillarelektrophorese (CE) ein zellulärer Assay etabliert, um verschiedene Inhibitoren von NPP1 zu analysieren. Es zeigte sich, dass die natürliche Substanzklasse der sauren Polysaccharide inhärent die Aktivität von NPP1 beeinträchtigt. Insbesondere die kommerziellen Heparine und Fondaparinux stachen mit einer hohen Potenz hervor und kamen deshalb zur Evaluation immunonkologischer Effekte der NPP1-Inhibition in Betracht. <br /> Eine Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Zytostatikaresistenz und EN-Aktivität brachte unterschiedliche Ergebnisse hervor. Bei Ovarialkarzinomzellen zeigte sich eine stärkere Expression der EN durch die resistente Variante im Verhältnis zur Wildtypzelle. Die Exposition mit Cisplatin änderte die EN-Expression jedoch nicht. An der Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 blieb die EN-Expression zwar unter Doxorubicin unverändert, allerdings wurde unter dem Einfluss des Kollagens eine EN-Induktion detektiert. <br /> Durchflusszytometrische Untersuchungen der CD4⁺ T-Zellen zeigten, dass heparinisierte U87-Zellen durch eine gehemmte NPP1-Aktivität eine verringerte Präsenz immunsuppressiver, regulatorischer T-Zellen (T_reg) hervorrufen. Dies wurde anhand der reduzierten Sekretion des T_reg-Zytokins IL-10 bestätigt. Weiterhin wurde die Zytotoxizität der natürlichen Killerzellen gegenüber Tumorzellen durch Heparinzusatz wieder reaktiviert. Abschließend wurde festgestellt, dass mittels Heparinintervention gegen NPP1 auf U87 nicht die Aktivität immunsuppressiver Komponenten gesenkt, sondern auch das Zytokinprofil der CD4⁺ T-Zellen insgesamt in Richtung eines antitumoralen Milieus verschoben wurde. <br /> Die Resultate der Arbeit stellen heraus, dass die Heparine durch NPP1-Inhibition im Rahmen der angewendeten in-vitro-Modelle eine Immunstimulation gegenüber dem Tumor bewirken. Sie empfehlen sich für eine weitergehende immunonkologische in-vivo-Evaluation.