Entwicklung und Anwendung verschiedener ELISA-Verfahren zum Nachweis von plasmatischem und thrombozytärem Gerinnungsfaktor V

Abstract

Der Gerinnungsfaktor V (FV) ist ein Bestandteil der plasmatischen Gerinnungskaskade. Der gesamte Prozess mit allen beteiligten Komponenten, Regulationsmechanismen, Interaktionen und Abläufen wird als Hämostasesystem bezeichnet. Faktor V stellt ein zentrales Protein mit vielfältiger Funktion innerhalb der Blutgerinnung dar. Es existieren unterschiedliche Varianten des Faktor V, welche sich strukturell und funktionell unterscheiden. Bisher ist unter anderem bekannt, dass etwa 80% des Gesamtbestandes an Faktor V im Plasma vorliegt und etwa 20%, teils in aktivierter Form, sich gespeichert in den Thrombozyten befinden. Die heutigen Erkenntnisse über die prozentuale Verteilung von plasmatischem und thrombozytärem Faktor V und die Quantifizierung beruhen auf den in 1982 publizierten Studien von Tracy et. al. Mit der hier vorgelegten Arbeit sollte eine auf diskriminierenden ELISA-Methoden basierende Quantifizierung des Faktor V erfolgen. Um plasmatischen und thrombozytären Faktor V quantitativ bestimmen zu können, wurden in der hier vorgelegten Arbeit vier Sandwich-ELISA entwickelt, welche durch die Kombination verschiedener Fänger- und Detektionsantikörper die unterschiedlichen Varianten des FV spezifisch erfassen sollten. <br /> Unter Anwendung dieser ELISA-Verfahren wurde die Konzentration von FV sowohl in Plasmaproben als auch in Thrombozytenlysaten von gesunden Blutspendern bestimmt. Hierbei zeigten sich im Rahmen der Bestimmung von plasmatischem FV vergleichbare Messwerte unter Anwendung der vier verschiedenen ELISA-Verfahren, was deren Eignung zur Erfassung von plasmatischem FV prinzipiell bestätigte. Hier zeigte sich eine mittlere Konzentration von 3,83 +/- 0,23 µg je ml Plasma. Bei der Bestimmung von thrombozytärem Faktor V zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede bezüglich der erhaltenen Testergebnisse. So wurden, wie auch zu erwarten war, die höchsten Messwerte im Bereich von 0,1024µg je ml Lysat (Standardabweichung 0,95) mit einem polyklonalen Testansatz erreicht (ELISA #2), welcher nicht in der Lage war zwischen den verschiedenen Formen des FV zu unterscheiden. Andererseits stand mit einer spezifisch die leichte Kette des FV fangenden und die schwere Kette des FV detektierenden Antikörperkonstellation ein Assay zur Verfügung (ELISA #3), der vornehmlich die nichtaktivierte Form des FV erfasste. Unter Anwendung dieses Testverfahrens wurde in den Lysatproben lediglich eine FV-Konzentration von 0,0189 µg/ml (Standardabweichung 0,088) ermittelt. Diese Ergebnisse zeigen in Kombination auf, dass FV in Thrombozyten hauptsächlich in aktivierter Form vorliegt. <br /> Des Weiteren zeigte sich, dass ein gegen die Aminosäuren 500-513 der schweren Kette des FV affinitätsgereinigter, polyklonaler Antikörper nicht in der Lage war an aktivierten FV zu binden. Während hierbei die biochemischen Hintergründe nicht geklärt werden konnten, wurden diese Ergebnisse durch Bindungsanalysen mittels Bio-Layer-Interferometrie bestätigt. Zudem konnten mit einem weiteren ELISA (#4) ein Setting entwickelt werden, das unter Fangen der leichten Kette des FV einen polyklonalen Read-Out auch in Thrombozytenlysaten lieferte. <br /> Das anteilige Vorkommen von Faktor V im Plasma und in den Thrombozyten wurde in dieser Studie mit 97% zu 3 % bestimmt. Auch konnten Erkenntnisse über den Aktivierungszustand des Faktor V im Thrombozyten gewonnen werden. Somit bilden die in dieser Arbeit vorgestellten ELISA-Tests die Grundlage für weiterführende Untersuchungen, etwa bezüglich des Blutungsrisikos bei Patienten mit einem Faktor V Mangel.