In vitro recapitulation of developmental transitions in human neural stem cells

Abstract

Progress made in pluripotent stem cell (PSC) technology potentially enables the production of almost any cell type in unlimited quantities for human specific models. This is particularly interesting for the generation of neuronal cells as the human brain differs considerably from commonly used animal models and human brain tissue samples are scarce, difficult to obtain and to propagate <em>in vitro</em>.<br /> In recent years it has become possible to isolate and expand neural stem cells (NSCs) from different sources using growth factor-based protocols. However, a still open question is to what extent these diverse stem cell systems reflect physiological stem cell states observed <em>in vivo</em> (Conti et al. 2010).<br /> During nervous system development, early neuroepithelial stem (NES) cells with a highly polarized morphology and responsiveness to regionalizing morphogens give rise to radial glia (RG) cells, which generate region-specific neurons. Stable neural cell populations reminiscent of NES cells have been obtained from pluripotent stem cells (lt-NES cells) and the fetal human hindbrain (hbNES cells) (Tailor et al. 2013; Koch et al. 2009b).<br /> In this study a sequential differentiation protocol was developed enabling the <em>in vitro</em> generation of RG-like neural stem cells from NES-like cells (lt-NES and hbNES cells). By employing differentiating conditions NES-like cells were coaxed into following the <em>in vivo</em> developmental transition of neural stem cells into a RG-like phenotype. Indeed, this newly established NSC population exhibits important features of multipotent neuro- and gliogenic RG cells. These RG-like NS cells could be expanded for at least 25 passages and express classical NSC markers such as Nestin and SOX2 as well as markers typically associated with RG cells including SOX9, CD44, AQP4 and HOP, while the NES cell markers PLZF, DACH1, ZO1 and MMRN1 were down-regulated.<br /> Importantly, RG-like cells generated from PSC-derived lt-NES cells and from primary hbNES cells showed similar properties as primary RG cells obtained from fetal tissue, indicating that conversion of NES-like cells into RG-like cells recapitulates the developmental progression of early NES cells into radial glia cells occurring <em>in vivo</em>.<br /> Key challenges associated with the biomedical application of PSC-derived neural stem cells are their controlled patterning towards distinct regional subtypes and the maintenance of an acquired regional phenotype across multiple passages of <em>in vitro</em> expansion.<br /> Previous studies have shown that lt-NES cells, shortly after their derivation from PSC, undergo gradual posteriorization into an anterior hindbrain phenotype, which might be due to regionalizing effects of the growth factors employed for <em>in vitro</em> proliferation (Bithell et al. 2008; Koch et al. 2009b). This behavior is in line with their <em>in vivo</em> role in which they respond to morphogens in order to establish different regions of the brain. In a second step this regional identity is consolidated in RG cells which can no longer be influenced by regionalizing factors.<br /> In order to harness this property of RG cells, RG-like NS cells were generated from dorsal forebrain-, ventral forebrain-, hindbrain- and spinal cord-patterned NES-like cells. The resulting regionalized RG-like NS cell populations express transcription factors appropriate for their positional identity across multiple passages of <em>in vitro</em> expansion while maintaining their differentiation potential into neurons and glia. Reminiscent of heterotopic transplantation studies, even under the influence of strong rationalizing factors <em>in vitro</em> the positional identity of dorsal forebrain-like NS cells remained stable (Onorati et al. 2011). Following differentiation RG-like cells generated region-specific neurons appropriate for their positional identity. These results indicate that conversion into RG-like cells may provide a route for conserving the regional identity of pre-patterned early NES cells and establishing regionally stable neural stem cell lines for biomedical application.

In den letzten Jahren erzielte Fortschritte in der pluripotenten Stammzelltechnologie ermöglichen es potentiell, alle Zelltypen des Körpers in nahezu unbegrenzter Menge für die Verwendung in humanspezifischen Modellen zu generieren. Insbesondere das menschliche Gehirn unterscheidet sich wesentlich von dem der üblicherweise eingesetzten Tiermodelle und zudem sind Gewebeproben des menschlichen Gehirns schwer zugänglich und die daraus gewonnenen Zellen nur unzureichend <em>in vitro</em> vermehrbar. Daher ist besonders die Aussicht, humane neuronale Zellen aus pluripotenten Stammzellen (PSZ) zu gewinnen, sehr attraktiv.<br /> Neuste Entwicklungen in den letzten Jahren haben es ermöglicht neurale Stammzellen aus unterschiedlichen Quellen zu isolieren oder zu generieren und unter Einsatz von Wachstumsfaktor-basierten Protokollen zu vermehren. Eine noch offene Frage ist jedoch, inwieweit diese verschiedenen Stammzellsysteme <em>in vitro</em> physiologische, <em>in vivo</em> existierende Stammzellstadien nachbilden.<br /> Während der physiologischen Entwicklung des Nervensystems entstehen aus frühen, neuroepithelialen Stammzellen (NES), welche eine hochgradig polarisierte Morphologie aufweisen und empfindlich auf sogenannte regionalisierende Morphogenen reagieren, späte radiale Gliazellen (RG), die dann wiederum regionalspezifische Neurone generieren.<br /> <em>In vitro</em> konnten bislang stabil proliferierenden neurale Stammzellpopulationen, welche neuroepithelialen Stammzellen gleichen, sowohl von humanen pluripotenten Stammzellen (lt-NES Zellen) als auch direkt aus dem fetalen humanen Hinterhirn (hbNES Zellen) gewonnen werden.<br /> Darauf aufbauend wurde in dieser Arbeit ein sequentielles Differenzierungsprotokoll entwickelt, das die Generierung von RG-ähnlichen neuralen Stammzellen (RG-ähnliche NS Zellen) aus NES-ähnlichen Zellen (lt-NES und hbNES Zellen) <em>in vitro</em> ermöglicht. Durch die zeitlich begrenzte Anwendung differenzierender Zellkulturbedingungen werden NES-ähnliche Zellen dazu gebracht, die Entwicklung neuraler Stammzellen <em>in vivo</em> nachzuvollziehen und RG-ähnliche Zellen zu generieren.<br /> Tatsächlich weist diese neu etablierte neurale Stammzellpopulation wichtige Merkmale von neuro- und gliogenen RG Zellen auf. RG-ähnliche NS Zellen können für mindestens 25 Passagen expandiert werden und exprimieren klassische neurale Stammzellmarker wie NESTIN und SOX2 sowie typischerweise RG Zell-assoziierte Marker wie SOX9, CD44, AQP4 und HOP während die NES Zell Marker PLZF, DACH1, ZO-1 und MMRN1 herunterreguliert werden.<br /> Eine wichtige Erkenntnis dieser Studie ist, dass RG-ähnliche NS Zellen - generiert von PSZ-abgeleiteten lt-NES Zellen oder primär isolierten hbNES Zellen - ähnliche Eigenschaften zeigen wie primär aus fetalem Gewebe gewonnene RG Zellen. Dies deutet darauf hin, dass der Übergang von NES-ähnlichen Zellen in RG-ähnliche Zellen <em>in vitro</em> in der Tat die Entwicklung von frühen NES Zellen in RG Zellen während der Neurogenese <em>in vivo</em> nachvollzieht.<br /> Eine große Herausforderung, im Hinblick auf die biomedizinische Anwendung von aus PSZ-abgeleiteten neuralen Stammzellen, ist ihre kontrollierte Entwicklung in unterschiedliche regionale Subtypen und die Aufrechterhaltung eines erworbenen regionalen Phänotyps während ihrer Kultivierung und Expansion <em>in vitro</em>. Vorangegangenen Arbeiten haben gezeigt, dass lt-NES Zellen kurz nach ihrer Generierung aus PSZ einen anterioren Vorderhirn Phänotyp aufweisen und in der Folge eine sukzessive regionale Posteriorisierung in einen Phänotyp durchlaufen, welcher dem ventralen Hinterhirn entspricht. Dieses Phänomen ist vermutlich auf die regionalisierenden Effekte der für die Proliferation <em>in vitro</em> notwendigen Wachstumsfaktoren (FGF2 und EGF) zurückzuführen.<br /> Dieses Verhalten entspricht auch der Rolle von NES Zellen <em>in vivo</em>, wo sie zunächst auf Morphogene ansprechen und auf diese Weise die verschiedenen Regionen des Gehirnes generieren. In einem zweiten Schritt wird diese regionale Identität durch den Übergang in RG Zellen, welche nicht mehr durch regionalisierend Faktoren beeinflussbar sind, konsolidiert.<br /> Um die Eigenschaft von RG Zellen, eine stabile regionale Identität zu besitzen, nutzbar zu machen, wurden zunächst RG-ähnliche NS Zellen von NES-ähnlichen Zellen mit unterschiedlicher regionalen Phänotypen abgeleitet (ventrales Vorderhirn, dorsales Vorderhirn, Hinterhirn, Rückenmark). Die hieraus gewonnenen regionalisierten RG-ähnlichen NS Zellpopulationen exprimieren trotz Exposition zu Wachstumsfaktoren über zahlreiche Passagen stabil Transkriptionsfaktoren, welche ihrer regionalen Identität entsprechen ohne zu posteriorisieren und behalten über die Zeit, die Fähigkeit sowohl in Neurone, als auch in Gliazellen zu differenzieren. In Anlehnung an Studien zur heterotopen Transplantation von RG Zellen in Mäusen <em>in vivo</em> wird die regionale Identität von RG-ähnlichen Zellen selbst unter dem Einfluss starker regionalisierender Faktoren wie beispielweise Retinsäure aufrechterhalten. Werden diese regionalisierten RG-ähnliche NS Zellen differenziert, generieren sie zudem neuronale Subtypen, welche ihrer regionalen Identität entsprechen.<br /> Die Ergebnisse dieser Studie deuten zusammenfassend darauf hin, dass die Überführung in RG-ähnliche NS Zellen eine Methode darstellt, die regionale Identität von frühen regionalisierten NES Zellen zu konservieren und so regional stabile neurale Stammzelllinien für biomedizinische Anwendungen zu etablieren.