Die Signaltransduktion über Inositol-1,4,5-trisphosphat in Sonnenblumen-Hypokotylprotoplasten am Beispiel des Schwerkraftreizes

Abstract

Sonnenblumen-Hypokotylprotoplasten (HCPs) wurden als Model zur Prüfung der Hypothese verwendet, daß das PI-System Bestandteil der schwerkraftinduzierten Signaltransduktion ist. Hierzu wurde der <i>second messengers</i> Ins(1,4,5)P₃, als ein zentrales Intermediärprodukt der PI-System abhängigen Signaltransduktion quantitativ in HCP-Extrakten analysiert.<br /> Zunächst wurde eine Methode entwickelt, mit der sich vitale Protoplasten schnell und in ausreichender Menge isolieren ließen. Zur Vitalitätsbeurteilung wurde neben den üblichen Vitalitätstests (lichtmikroskopische Beurteilung, FDA-Test), eine weitere Methode etabliert, mit der die Auxin-abhängige Aktivierung der <i>PM/H⁺-ATPase in vivo</i> gemessen werden konnte. Diese berücksichtigt auch mögliche Rezeptorschäden an der Plasmamembran und ermöglicht es zudem die Versuchsbedingungen des Protoplasten-Systems zu verbessern.<br /> Mit dem optimierten Protoplasten-System konnte eine konzentrationsabhängige Aktivierung der <i>PM/H⁺-ATPase</i> durch Auxin gemessen werden, die sich durch den H⁺-ATPase-Inhibitor DCCD inhibieren ließ. Eine Inhibierung durch den PI-System-Inhibitor Neomycin war unter den gegebenen Bedingungen nicht nachweisbar. Daher ist eine Beteiligung des PI-Systems an der Auxin-abhängigen Aktivierung der <i>PM/H⁺ATPase</i> eher unwahrscheinlich. Dennoch ergaben Zeitreihenuntersuchungen quantitative Veränderungen der Ins(1,4,5)P₃-Gehalte in Auxin-stimulierten (100 µM) HCPs.<br /> Mit der <i>mdd</i>-HPLC (metal-dye-detection HPLC) wurde eine Methode zur nicht-radioaktiven Detektion und Quantifizierung von Ins(1,4,5)P₃ in HCP-Extrakten etabliert. Nach einer erforderlichen Optimierung der Hardware konnte Ins(1,4,5)P₃ isomerspezifisch und hoch sensitiv (10 pmol) detektiert werden. Die Analysen von HCP-Extrakten mit der alkalischen <i>mdd</i>-HPLC zeigten einen mit Ins(1,4,5)P₃ koeluierender Peak, dessen Identität durch drei unabhängige Methoden (3-Phytase-Abbau, UV-Absorption, Rechromatographie) bestätigt wurde.<br /> Experimente mit simulierter Schwerelosigkeit sowie mikro-Gravitation ergaben erste Hinweise, daß HCPs als autonome Einheit Veränderungen des <i>g</i>-Vektors wahrnehmen können und stützen somit die Hypothese, daß das PI-System an der Umsetzung des physikalischen Reizes Schwerkraft in ein chemisches Signal beteiligt ist. Ferner konnte gezeigt werden, daß auch eine mechanische Stimulation zu einer Aktivierung des PI-Systems in HCPs führt.

Gravity-dependent signaltransduction of Inositol-1,4,5-trisphosphat in sunflower-hypocetylprotoplasts<br /> Protoplasts of sunflower hypocotyls (HCPs) were used as a model to prove the hypothesis that the PI-System is part of the gravi-induced signal-transduction. Therefore a method had to be developed to isolate a large quantity of vital protoplasts. <br /> To investigate the vitality of the protoplasts a further method beside the classical tests (light- microscopy, FDA-test) has been established, which measures the auxin-dependent activation of the <i>PM/H⁺-ATPase</i> <i>in vivo</i>. This method also considers a defective receptor at the plasmamembrane and is a useful tool to optimise the conditions of the protoplast-system.<br /> Using the optimized protoplast-system, a concentration-dependent activation of the <i>PM/H⁺-ATPase</i> in response to auxin was observed. The effect could be repressed by the H⁺-ATPase inhibitor DCCD. Since neomycin (an inhibitor of the PI-system) did not inhibit the auxin-dependent activation of the <i>PM/H⁺-ATPase</i>, there is no evidence that the PI-System is part of the auxin-induced signal-transduction which leads to an activation of the <i>PM/H⁺-ATPase</i>. Nevertheless, auxin (100 µM) also causes time- dependent changes of free Ins(1,4,5)P₃, the main intermediate product of the PI-System dependent signal-transduction, in auxin-stimulated HCPs.<br /> To detect and quantify the <i>second messenger</i> Ins(1,4,5)P₃ in HCP-extracts a non-radioactive method called metal-dye-detection HPLC (<i>mdd</i>-HPLC) has been established. After optimising the hardware this highly isomer-specific method could detected Ins(1,4,5)P₃ down to 10 pmol. Running HCP-extracts through the alkaline <i>mdd</i>-HPLC one peak showed co-elution with Ins(1,4,5)P₃. Three newly developed, independent methods (3-phytase-breakdown, UV-absorption, rechromatography) confirmed the identity. <br /> Experiments with simulated weightlessness and micro-gravity gave first indications that HCPs present autonomous units, which are capable of sensing a changing <i>g</i>-vector. Moreover, they enforce the hypothesis that the PI-system is part of the signal-transduction-chain, converting the physical stimulus into a chemical signal. Furthermore it has been shown that a simple mechanical stimulation of HCPs leads to an activation of the PI-system.