SMNrp und TUBA

Abstract

Spinale Muskelatrophie, die zweithäufigste autosomal rezessive Erbkrankheit mit Todesfolge beim Menschen, wird durch Mutationen im <em>SMN1</em>-Gen verursacht, die zu einem Mangel an funktionellem SMN-Protein in den Zellen führen. SMN besitzt eine konservierte Tudor-Domäne und lokalisiert im Cytoplasma und im Zellkern. Das Protein ist Teil makromolekularer Komplexe und wird für die Zusammenlagerung der spleißosomalen snRNPs und vermutlich auch anderer RNA-Protein-Partikel benötigt. Am Anfang dieser Arbeit stand die Frage, ob es verwandte Proteine von SMN im Menschen mit einer möglicherweise ähnlichen Funktion gibt. Durch Datenbanksuchen wurden zwei bisher unbekannte, ubiquitär exprimierte Gene entdeckt, die für Proteine mit signifikanter Homologie zu SMN codieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung dieser Proteine. <br /> Das <em>SMN related protein</em> (SMNrp), das erste der beiden, besteht aus 238 Aminosäuren, und lokalisiert im Zellkern. Hier wird es an Perichromatinfibrillen gefunden, die als aktive Bereiche der Transkription und des prä-mRNA-Spleißens gelten. SMNrp ist mit dem spleißosomalen 17S-U2-snRNP assoziiert. Es konnte <em>in vitro </em>und<em> in vivo</em> gezeigt werden, dass das Protein ein essentieller Spleißfaktor ist, der noch vor der ersten Transesterifizierungsreaktion des mehrschrittigen Prozesses benötigt wird. Daneben hat SMNrp möglicherweise auch eine Funktion bei der Aktivierung der Transkription. So wurde durch <em>Two-Hybrid-Screen</em> die Histon-Acetyltransferase GCN5-S als putativer Interaktor von SMNrp identifiziert. Bindungsstudien zeigen, dass die Tudor-Domäne von SMNrp für die Bindung an GCN5-S benötigt wird. SMNrp hat einen bedeutenden Einfluss auf die Acetylierungsaktivität von GCN5-S. Ein SMNrp-GCN5-S-Komplex ist in der Lage, <em>in vitro</em> Histone zu acetylieren, die in Nucleosomen verpackt sind. Dieses eigentliche <em>in-vivo</em>-Substrat der Acetyltransferase kann von GCN5-S alleine nicht modifiziert werden. Demnach könnte SMNrp ein Cofaktor von GCN5-S im Zellkern sein, der die katalytische Aktivität des Enzyms entscheidend moduliert. Mit seiner Rolle beim Spleißen und vermutlich auch bei der Transkriptionsaktivierung wurde mit SMNrp ein Protein beschrieben, das, wie auch das homologe SMN, offenbar verschiedene Funktionen in der Zelle hat. <br /> Das <em>Tudor </em>and<em> UBA domain-containing protein</em> (TUBA), das zweite der beiden neu entdeckten Proteine, besteht aus 744 Aminosäuren und lokalisiert im Zellkern und im Cytoplasma. Über seine Ubiquitin-assoziierte (UBA-) Domäne bindet TUBA <em>in vitro </em>spezifisch an Lys₄₈-verknüpfte Ubiquitin-Ketten. In der Zelle interagiert TUBA dadurch vermutlich mit Proteinen, die für den Abbau am 26S-Proteasom markiert sind. Darüberhinaus konnten noch weitere Interaktionspartner von TUBA identifiziert werden: Über seinen N-Terminus bindet TUBA an die erst kürzlich entdeckte DNA-Topoisomerase-III-beta (TOP3β). Die Bedeutung dieser Interaktion ist noch unklar. So zeigt TUBA keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität von TOP3b in Decatenierungsexperimenten. Außerdem wurden FMRP, das Produkt des Krankheitsgens des Fragilen-X-Syndroms, und seine Homologen FXR1 und FXR2 als TUBA-Interaktoren identifiziert. TUBA und FMRP zeigen ein ähnliches Sedimentationsverhalten bei der Dichtegradienten-Zentrifugation und colokalisieren partiell im Cytoplasma. Ein Einfluss von TUBA auf die Funktion von FMRP als Inhibitor der Translation in vitro konnte nicht nachgewiesen werden. Interessanterweise kann aber die Austauschmutante FMRP-I304N nicht mehr mit TUBA interagieren. Diese Mutante stammt aus einem Patienten mit einem stark ausgeprägten Fragilen-X-Syndrom. Der beobachtete TUBA-Bindungsdefekt könnte daher eine Rolle bei der Entstehung der Krankheitssymptome spielen.