Untersuchung der Lipidnachbarschaft von derivatisiertem GM1 in Modellmembranen und kultivierten Zellen

Abstract

In eukaryontischen Zellen und ihren Organellen sind die begrenzenden Membranen aus einer Vielzahl von verschiedenen Lipid- und Proteinmolekülen zusammengesetzt. <br /> Der Aufbau solcher Membranen erfolgt jedoch nicht nur nach rein statistischen Verteilungen, sondern es kann innerhalb der Membranhälften der Lipiddoppelschicht zu einer bestimmten Anordnung bzw. einer Domänenbildung von Lipiden und Proteinen kommen. <br /> Am Beispiel des Gangliosids GM1 wurde untersucht, wie sich die Lipidumgebung von Glykosphingolipiden im Zuge ihrer Endozytose in kultivierten Zellen verändert.<br /> Dazu wurden radioaktiv markierte Derivate von GM1 synthetisiert, welche an Hand chemischer Markierungen in der Zelle beobachtet werden konnten. So wurden Derivate hergestellt, die in ihrer Acylkette ein Fluorophor (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl-amino-Gruppe (NBD-Gruppe)) tragen und fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden können. Eine andere Derivatisierung der Acylkette erfolgte durch Einführung einer photolabilen Trifluormethylphenyldiazirinyl-Gruppe (TPD-Gruppe), die nach Belichtung mit UV-Licht kovalent an eines ihrer direkt benachbarten Moleküle binden. Auf Grund unterschiedlicher Verhalten innerhalb der Zelle wurden zwei Derivate verschiedener Kettenlänge synthetisiert. Außerdem wurde ein an der Sialinsäure derivatisiertes Biotin-GM1 hergestellt und durch Anti-Biotin-Antikörper elektronenmikroskopisch in der Zelle lokalisiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich diese Derivate in bestimmten Bereichen der Plasmamembran akkumulieren. <br /> Für die Experimente mit TPD-Derivaten wurden zunächst in Liposomen Kopplungsprodukte (als Referenzen) hergestellt, die mittels Dünnschichtchromatographie und Massenspektrometrie (MALDI-/ESI-MS) charakterisiert werden konnten. <br /> Die kurzkettigen Gangliosidderivate konnten an Albumin gebunden unter Temperaturblock in die Plasmamembran von Fibroblasten inkorporiert werden. Dabei zeigte sich, dass diese Derivate nach Insertion in die Plasmamembran von kultivierten Fibroblasten in sehr cholesterolreiche Umgebungen segregieren, die als Mikrodomänen bzw. „rafts“ bezeichnet werden. Weitere Kopplungsprodukte mit anderen Hauptbestandteilen der extrazellulär orientierten Membranhälfte wie Phosphatidylcholin (PC) oder Sphingomyelin (SM) konnten hierbei nur in geringem Maße nachgewiesen werden. In Modellmembranen hingegen konnte keine besondere Affinität bezüglich eines Kopplungspartners festgestellt werden. Auch zeigte sich, dass im Zuge der Endozytose (nach Aufhebung des Temperaturblocks), die Sonden sich auf intrazellulären Vesikeln und inneren Membranen in einer gänzlich anderen Lipidnachbarschaft befinden. Es konnten keine Präferenzen zu Cholesterol mehr festgestellt werden, stattdessen traten vermehrt Kopplungen mit Phosphoglycerolipiden wie PC oder auch Sphingomyelin auf. <br /> Die langkettigen Derivate konnten ebenfalls in Modellmembranen inseriert und ihre Kopplungsprodukte charakterisiert werden. Allerdings war es hierbei nicht möglich bei Temperaturen zu arbeiten, die die Endozytose blockieren, da Ganglioside mit langer Acylkette (größer C₁₂) nicht aus einem BSA-Lipid-Komplex in Zellmembranen zu inserieren sind. Jedoch reichern sie sich in abbauenden Organellen, wie späte Endosomen oder Lysosomen, an. So konnte hier in verschiedenen Zelltypen (mit und ohne pathologische Defekte) ein BMP-Kopplungsprodukt gefunden werden. Dies bestätigt die Vermutung, dass BMP sich auf intraendosomaler/-lysosomaler Vesikel befindet und hier den Abbau von Membranbestandteilen stimuliert. Bei beiden TPD-Derivaten fällt der hohe Anteil an Kopplungsprodukt von Photosonde und Wasser auf. Dieser ist auf den Wassergehalt in Membranen und auf Kopplungen mit Wasser außerhalb der Membranen zurückzuführen, welche durch die „off-rate“ der verwendeten Sonden bedingt ist. Dass die „off-rate“ eine große Rolle spielt, wird dadurch deutlich, dass das kurzkettige C₅-TPD-Derivat (mit hoher „off-rate“) zu einem weitaus höheren Anteil in Wasser inseriert, als die entsprechende langkettige Verbindung (C₁₀-TPD-GM1).