Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im Aromatenbiosyntheseweg in L–Phenylalanin Produzenten von <i>Escherichia coli</i>

Abstract

Die Metabolomanalyse gewinnt zunehmend an Bedeutung für die Untersuchung der Eigenschaften, Funktion und Kinetik von Stoffwechselsystemen auf intrazellulärem Niveau. Am Beispiel der Aromatenbiosynthese in Escherichia coli (E. coli) wurde das Prinzip des „Metabolic Profiling“, d.h. der quantitativen Messung von intrazellulären Stoffwechselmetaboliten, für die Untersuchung von rekombinanten L-Phenylalanin Produktionsstämmen von E. coli angewendet. <br /> Die Fermentationsexperimente wurden unter dynamischen Bedingungen durchgeführt, d.h. unter substratlimitierten (glukoselimitierten) Bedingungen wurde schlagartig ein Glukosepuls zugesetzt. Um die schnelle intrazelluläre Antwort der Zellen auf die Substratzugabe aufzuzeichnen wurde eine automatisierte Technik zur schnellen Probenahme im subsekunden-Bereich eingesetzt. Durch parallele Abkühlung der Probe auf -20°C wurde gleichzeitig der Metabolismus der Zellen gestoppt. Nach der Aufarbeitung der Proben wurde der dynamische Verlauf der intrazellulären Metabolitkonzentrationen im Verlauf des Pulsexperimentes in den Zellextraktproben mittels einer neu entwickelten LC–MS/MS Methode gemessen.<br /> In der Arbeit wurden sowohl ein LC-MS mit Ionenfallentechnik für die Strukturaufklärung von Metaboliten, als auch ein LC-MS mit Triple-Quadrupol-Technik für die Quantifizierung der Metaboliten eingesetzt. Für eine exakte Quantifizierung der LC-MS Messungen wurde die Standard-Additions-Methode eingesetzt, wobei die nicht kommerziell verfügbaren Metaboliten aus dem Aromatenbiosyntheseweg chemisch bzw. mikrobiell durch Fermentation gentechnisch geblockter E. coli Mutanten dargestellt wurden. <br /> Die Fermentationsexperimente mit Glukosepuls wurden im Fed–Batch Verfahren unter produktionsrelevanten Bedingungen durchgeführt, so dass die Ergebnisse Rückschlüsse auf den Produktionsprozess zulassen konnten. Die Stimulation des Stoffwechsels durch den Glukosepuls konnte dabei nicht nur im katabolen Stoffwechsel (Glykolyse, Pentose-Phosphat-Weg), sondern auch in Metaboliten der Aromatenbiosynthese auf dem Weg zum L–Phenylalanin nachgewiesen werden.<br /> Die gemessenen intrazellulären Konzentrations-Zeit-Verläufe der Metaboliten wurden mit einfachen statistischen Methoden ausgewertet. Die Daten identifizierten die 3-Dehydroquinat-Synthase (aroB), die Shikimat-Kinasen (aroK, aroL) und die EPSP-Synthase (aroA) als Biosyntheseschritte mit hoher Flusskontrolle durch den Aromatenbiosyntheseweg.

<strong>Metabolome analysis for the investigation of dynamic in the aromatic biosynthesis pathway in a L-phenylalanine <i>Escherichia coli</i> production strain</strong><br /> Metabolome analysis is gaining interest for the investigation of the properties, function and kinetics of metabolic systems at intracellular level. Using the aromatic biosynthesis in Escherichia coli (E. coli) the principle of “metabolic profiling”, meaning the quantitative measurement of intracellular metabolites was applied for the investigation of recombinant L-phenylalanine production strains of E. coli.<br /> Fermentation experiments were conducted under dynamic conditions, meaning the rapid addition of a glucose pulse to the glucose limited fermentation culture. To monitor the fast intracellular metabolism response of the cells an automated rapid sampling technique was used allowing sampling on a subsecond time scale. Parallel cooling of the samples to -20°C simultaneously stopped metabolism activity. After sample preparation the dynamic response of the intracellular metabolite concentrations during the glucose pulse experiment were measured with a newly developed LC-MS/MS method. <br /> Two different LC-MS systems were used in this work. Structure analysis of metabolites was performed with a LC-MS with ion-trap technique and metabolite quantification was done with a LC-MS with triple-quadrupole technique. To correct for matrix effects during quantification, the standard-addition-method was used. Commercially non-available metabolites from the aromatic biosynthesis were prepared chemically or fermentatively with the aid of genetically blocked E. coli mutant strains.<br /> The fermentation experiments with glucose pulse were conducted in fed-batch mode under conditions relevant to the L-phenylalanine production process. The glucose pulse induced metabolism stimulation was detected in the catabolic metabolism (glycolysis, pentose-phosphate-pathway) and in the metabolite pools of the aromatic biosynthesis leading to L-phenylalanine. <br /> The measured intracellular concentration-time-courses of the metabolites were interpreted with simple statistical methods. The data identified 3-dehydroquinate synthase (aroB), shikimate kinases (aroK/aroL) and EPSP-synthase (aroA) to be of high flux control in the aromatic biosynthesis pathway.