Untersuchungen zur O-GlcNAc Modifikation neuraler Proteine

Abstract

Die intrazelluläre Modifikation der Serin- und Threoninreste von cytosolischen und Kernproteinen mit einem N-Acetylglucosamin (O-GlcNAc) ist ubiquitär verbreitet und bei allen bisher daraufhin untersuchten eukaryotischen Spezies sowie in allen Gewebetypen nachgewiesen worden. <br /> Im ersten Teil des vorliegenden Projekts sollte die O-GlcNAc Modifikation neuraler Proteine aus Hirnhomogenaten von Alzheimer Patienten und Kontrollpersonen näher untersucht und Proteine mit unterschiedlicher O-GlcNAc Modifikation identifiziert werden. Mit den verwendeten Methoden konnten keine entsprechenden Proteine mit unterschiedlicher Glykosylierung identifiziert werden. <br /> Während die O-GlcNAc Modifikation des murinen Amyloid Precursor Proteins bereits nachgewiesen wurde, konnte die des humanen APP im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden. In vivo weist die unreife APP Form eine stärkere O-GlcNAc Modifizierung im Vergleich zur reifen Form auf. Bei stabil mit dem humanen APP695 transfizierten unbehandelten murinen Neuroblastoma-Zellen (d. h. in vitro) konnte nur eine schwache O-GlcNAc Modifizierung von APP Immunpräzipitaten nachgewiesen werden. Die Signalstärke steigt nach Behandlung der Zellen mit PUGNAc, einem Inhibitor der O-GlcNAc Hydrolase, erwartungsgemäß an, da PUGNAc die Abspaltung von O-GlcNAc hemmt. <br /> Interessanterweise konnte ein gleicher Anstieg ebenfalls nach Behandlung der Zellen mit Swainsonine, das als Inhibitor der Mannosidase II die Anreicherung der unreifen Form im ER begünstigt, beobachtet werden. Der stärkste Anstieg und somit ein synergistischer Effekt resultiert aus der kombinierten Behandlung mit PUGNAc und Swainsonine. Es konnte allerdings weder immunologisch noch massenspektrometrisch eine O-GlcNAc Modifikation des C-Terminus detektiert werden, der aus stabil mit dem C-Terminus transfizierten humanen Neuroblastoma-Zellen isoliert wurde. <br /> Ebenfalls auf früheren Untersuchungen basierend wurde im dritten Teil der Arbeit die Dynamik der O-GlcNAc Modifikation in murinen Kleinhirnneuronen untersucht und das Verhalten der O-GlcNAc Expression bei neuronalen Differenzierungsprozessen analysiert. Es konnte u.a. gezeigt werden, dass sich bei neuronalen Differenzierungsvorgängen die O-GlcNAc Expression verändert. So wurde eine verringerte O-GlcNAc Expression nach Induktion der neuronalen Differenzierung bei PC12-Zellen durch NGF festgestellt. Eine zusätzliche Behandlung der Zellen mit PUGNAc führt zur Ausbildung von signifikant kürzeren Neuriten im Vergleich zu den ausschließlich mit NGF behandelten Zellen, außerdem nimmt die O-GlcNAc Expression nicht ab im Vergleich zur Kultivierung ohne NGF bzw. sie nimmt zu im Vergleich zur Behandlung mit NGF allein. Ob eine ebenfalls verstärkte O-GlcNAc Expression, wie sie in bestimmten Hirnarealen bei AD-Patienten post mortem detektiert werden konnte, möglicherweise im Zusammenhang mit Dedifferenzierungsprozessen stehen, die von anderen Arbeitsgruppen in Hirngewebe von AD-Patienten nachgewiesen wurden, sollte in Zukunft in weiteren Versuchen geklärt werden.