Charakterisierung rekombinant hergestellter Faktor-VIII-Gen-Mutanten mittels Expressionsuntersuchungen in CHO-Zellen

Abstract

Die Hämophilie A, die durch einen Defekt im Faktor VIII Protein hervorgerufen wird, ist eine X-chromosomal vererbte Gerinnungsstörung, die mit einer Prävalenz von 1 in 5000 männlichen Neugeborenen auftritt. Das FVIII-Gen ist auf dem X-Chromosom bei Xq28 lokalisiert und hat eine Größe von 186 kb, aufgeteilt auf 26 Exone. Das FVIII-Protein besteht aus 2332 Aminosäuren, angeordnet in der Domänenstruktur A1-A2-B-A3-C1-C2. Im Verlauf der Prozessierung und der Aktivierung wird die B-Domäne schrittweise herausgeschnitten und hat im aktiven Protein scheinbar keine Funktion. Dieses wird durch die Behandlungsmöglichkeit von betroffenen Patienten mit B-Domänen-deletierten FVIII-Präparaten bestätigt.<br /> In ungefähr 13% der Fälle sind Missense-Mutationen für eine schwere Verlaufsform der Hämophilie A verantwortlich, wobei diese innerhalb der B-Domäne selten nachzuweisen sind. Es gibt Patienten, die eine Verminderung der Faktor-VIII-Aktivität vorweisen und bei denen nur eine Missense-Mutation in der B-Domäne gefunden wurde. Da die B-Domäne in der aktiven Form des Proteins nicht vorhanden ist, somit theoretisch keinen Einfluss auf die Aktivität hat, soll die Kausalität dieser Mutationen für einen hämophilen Phänotyp näher untersucht werden.<br /> Hierzu wurden verschiedene Missense-Mutationen (Pro928Arg, Val993Leu, Glu1038Lys, Asp1241Glu, Arg1310Gly, Asn1441Lys, Leu1462Pro, Glu1579Asp und Ala1591Ser) in einen FVIII-Wildtyp-Expressionsvektor mittels in vitro Mutagenese eingefügt. Die so veränderten FVIII-Proteinevarianten wurden anschließend in Chinesischen Hamster Ovar Zellen exprimiert und mit den funktionellen Eigenschaften des Wildtypproteins verglichen. Bei 8 der 9 veränderten Varianten wiesen wir aktive Proteine im Medienüberstand der Zellen nach, die sich in den spezifischen Aktivitäten, sowie in der Sekretionsrate mehr oder weniger vom FVIII-Wildtyp unterschieden. Allerdings rechtfertigte keine dieser Proteinvarianten eine mittelschwere (Glu1038Lys und Asn1441Lys) oder schwere (Pro928Arg, Val993Leu, Glu1579Asp und Ala1591Ser) Verlaufsform der Hämophilie A.<br /> Bei der Proteinvarianten Pro1462Leu könnte der Genotyp für den Phänotyp verantwortlich sein. In diesem Fall wurde im Zellkulturüberstand weder anhand der Aktivitätstests noch des Antigen-ELISAs FVIII-Protein nachgewiesen. Im Zell-Lysat dagegen war ein aktives Protein vorhanden. Aufgrund des fehlenden Proteins im Medium und der somit nicht vorhandenen Sekretion, scheint an dieser Aminosäureposition ein für die Sekretionsfunktion kritischer Bereich zu liegen und würde damit das erste, in der B-Domäne lokalisierte, funktionelle Epitop darstellen.<br /> Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Techniken können nun auf andere Gerinnungsfaktoren, die in unserer Arbeitsgruppe untersucht werden, übertragen und in der Routine für die Überprüfung der Kausalität von Missense-Mutationen eingesetzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die B-Domäne (an den untersuchten Positionen) im aktiven Protein keine Rolle spielt. Die Bedeutung der B-Domäne liegt vermutlich in den Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, wie den Chaperonen, bei der Sekretion des Proteins.