Functional analysis of genes during bovine preimplantation embryo development

Abstract

This study, the RNA interference (RNAi) approach was applied to suppress the expression of the maternal (C-mos) and embryonic (Oct-4) transcripts in bovine oocytes and embryos, respectively using microinjection of sequence specific double-stranded RNA (dsRNA). For this 435 bp C-mos and 341 bp Oct-4 dsRNA were synthesised and microinjected into the cytoplasm of immature oocytes and zygotes, respectively. In experiment 1, immature oocytes were categorized into three groups: those injected with C-mos dsRNA, water (RNase-free), and uninjected controls. In experiment 2, in vitro produced zygotes were categorized into three groups: those injected with Oct-4 dsRNA, water (RNase-free) and uninjected controls. The developmental phenotypes, the level of mRNA and protein expression were investigated after treatment in both experiments. Microinjection of C-mos dsRNA has resulted in reduction of C-mos transcript (70%) and protein after maturation compared to the water injected and uninjected controls (P < 0.01). From oocytes injected with C-mos dsRNA, 60% showed the extrusion of first polar body compared to 50% in water injected and 44% in uninjected controls. Moreover, only oocytes injected with C-mos dsRNA showed spontaneous activation. Microinjection of zygotes with Oct-4 dsRNA has also resulted in reduction in Oct-4 transcript abundance (72%) and protein at the blastocyst stage compared to the uninjected control zygotes (P < 0.01). The first cleavage, morula and blastocyst rate were not significantly different between three treatment groups. However, a significant reduction in the number of inner cell mass was observed in Oct-4 dsRNA injected embryos compared to the other groups. In conclusion, these results demonstrated that sequence specific dsRNA can be used to knockdown maternal or embryonic transcripts in bovine embryogenesis and therefor as a tool to study the function of genes.

<strong>Funktionelle Analyse von Genen in boviner preimplantativer Entwicklung </strong> <br /> In dieser Arbeit wurde der RNA interference (RNAi) Ansatz angewendet, um die Expression maternaler C-mos und embryonaler Oct-4 Transkripte in bovinen Oozyten bzw. Embryos mittels Mikroinjektion sequenzspezifischer doppelsträngiger RNA (dsRNA) zu unterdrücken. Hierzu wurden 435 bp C-mos und 341 bp Oct-4 dsRNA synthetisiert und in das Zytoplasma immaturer Oozyten bzw. Zygoten mikroinjiziert. In Experiment 1 wurden die immaturen Oozyten in drei Gruppen eingeteilt: mit C-mos dsRNA injizierte, mit Wasser (RNase-freiem) injizierte und uninjizierte Kontrollen. In Experiment 2 wurden die in vitro produzierten Zygoten in drei Gruppen eingeteilt: mit Oct-4 injizierte, mit Wasser (RNase-freiem) injizierte und uninjizierte Kontrollen. Entwicklungsphänotypen, mRNA Level und Protein Expression wurden nach der Behandlung in beiden Experimenten untersucht. Die Mikroinjektion von C-mos dsRNA resultierte in einer Reduktion von C-mos Transkript (70%) und Protein nach Maturation verglichen mit mit Wasser injizierten und uninjizierte Kontrollen (P < 0.01). 60% der mit C-mos dsRNA injizierten Oozyten zeigten Extrusion des ersten Polrkörpers verglichen mit 50% der mit Wasser injizierten und 44% der uninjizierten Kontrollen. Überdies zeigten einzig mit C-mos dsRNA injizierte Oozyten spontane Aktivierung. Die Mikroinjektion von Zygoten mit Oct-4 dsRNA resultierte ebenfalls in einer Reduktion von Oct-4 Transkriptabundanz (72%) und Protein im Blastozystenstadium verglichen mit den uninjizierten Kontrollzygoten (P < 0.01). Teilungs-, Morula- und Blastozystenrate waren nicht signifikant unterschiedlich zwischen den 3 Behandlungsgruppen. Ferner wurde eine signifikante Reduktion der Anzahl der Zellen der inneren Zellmasse in Oct-4 dsRNA injizierten Embryos beobachtet im Vergleich zu den anderen Gruppen. Diese Resultate demonstrieren, dass sequenzspezifische dsRNA zum Knockdown maternaler oder embryonalen Transkripte in der bovinen Embryogenese genutzt werden um die Funktion von Genen zu untersuchen.