Experimentelle Beeinflussung des Wachstumsverhaltensder Leberkarzinom Zelllinie HuH7 durch TGF-beta Rezeptormutanten

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist in manchen Regionen eines der häufigsten Karzinome des Menschen. Therapieoptionen und Gesamtüberleben für an HCC erkrankte Patienten sind außerordentlich limitiert. TGF-beta spielt eine Schlüsselrolle in der Hepatokarzinogenese. Obwohl TGF-beta ein Inhibitor epithelialer Proliferation ist, und nachweislich erhöhte Serumkonzentrationen bei an HCC erkrankten Patienten gefunden werden, entkommen karzinomatös transformierte Hepatozyten einer Wachstumsinhibition durch TGF-beta. Dies gibt ihnen einen Proliferationsvorteil gegenüber nicht TGF-beta resistenten Hepatozyten. Die vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit der experimentellen Beeinflussung und Wiederherstellung der antiproliferativen Wirkung von TGF-beta in HuH7 Zellen, einer humanen HCC Zelllinie, mittels stabiler Transfektion konstitutiv aktiver und dominant negativer TGF-beta Typ I Rezeptormutanten und der Untersuchung der Rezeptorexpression an klinischen HCC. Dazu wurden 10 klinische HCC untersucht. Tumor und peritumoröses Gewebe wurden zum Gewinn von Proteinen und RNA aufgearbeitet. Mittels rt-PCR und Western Blot wurde die Expression der TGF-beta Rezeptoren Typ I und Typ II auf RNA und Proteinebene untersucht und die Tumorproben mit dem gesunden Lebergewebe der gleichen Probe und mit den Ergebnissen von HuH7 und (als Kontrolle) mit HepG2 Zelllinien verglichen. Auf RNA Ebene ließen sich durch rt-PCR keine Unterschiede in den Proben nachweisen. Auch eine Mikrodeletion in einer Mikrosatelliten Sequenz, wie in der Literatur beschrieben, ließ sich in keiner untersuchten Probe nachweisen. Auf Proteinebene ließen sich sowohl in HuH7 Zellen, als auch in 60% der untersuchten Proben eine herabgesetzte Expression von TGFßRII Protein nachweisen. In 80% der Proben war TGFßRI im Tumor stärker exprimiert als im Peritumor. Zur Etablierung eines in-vitro Modells zur Rekonstitution der TGF-beta Funktion wurde zunächst die Resistenz von HuH7 Zellen gegen exogen zugeführtes TGFß1 in verschiedenen Konzentrationen in Zellkultur gezeigt. Unter gestaffelten Konzentrationen von TGFß1 wurde das Wachstumsverhalten der Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass erst ab Konzentrationen von 2 pmol eine Proliferationshemmung auftritt, und erst eine noch weitere Steigerung der TGFß1 Konzentration in Bereiche, die einer 5-fachen der höchsten gemessenen Konzentration in-vivo entsprechen, führt zu einer Einstellung der zellulären Proliferation mit Abnahme der absoluten Zellzahl. Zur Beeinflussung des Wachstumsverhaltens von HuH7 wurden diese mit Transgen tragenden Vektoren transfiziert: Eine konstitutiv aktive (CA) oder dominant negative (DN) TGF-beta Typ I Rezeptormutante wurde in pCMV5 eingebracht. Dann wurde der Vektor mit dem entsprechenden Transgen mittels Lipofectamine zusammen mit einem Neomycin-Resistenz tragenden pIRESneo Vektor im Verhältnis 10:1 stabil in HuH7 kotransfiziert und positive Klone mittels Neomycin selektioniert. Alle verwendeten Klone wurden mittels rt-PCR auf die Transkription der Transgene überprüft. Ausschließlich IRES transfizierte Klone dienten als Leerkontrolle. IRES, DN und CA Klone wurden in einem standardisierten Verfahren zwischen dem 3. und 5. Tag des Experiments in ihrer Phase exponentiellen Wachstums untersucht, und die Wachstumskinetiken der drei Gruppen mittels Kruskall-Wallis Test miteinander verglichen. Es ergab sich ein signifikant langsameres Wachstum der HuH7 CA Klone gegenüber der Kontrollgruppe (p=0,011). Ein signifikanter Unterschied zwischen DN und IRES Klonen konnte nicht nachgewiesen werden. HuH7 Zellen zeigen eine herabgesetzt Expression von TGFßRII Protein, vergleichbar mit 60% der untersuchten klinischen HCC. In HuH7 Zellen konnte durch Transfektion einer konstitutiv aktiven Typ I Rezeptormutante eine signifikante Wachstumsinhibition erreicht werden, d.h. die TGF-beta Resistenz wurde durchbrochen. So wurde im Rahmen vorliegender Dissertationsschrift ein Modell für weitere in-vitro und in-vivo Untersuchungen der TGF-beta abhängigen HCC Pathogenese etabliert. Bei Störung der TGF-beta Signaltransduktionskaskade auf Rezeptor Ebene wäre es auch zur Erforschung einer rekonstituierenden Behandlungsmöglichkeit des HCC geeignet.