Allosterische Modulation der durch Acetylcholin und weitere Agonisten ausgelösten Aktivierung von muskarinischen M₂-Rezeptoren

Abstract

Acetylcholin ist der endogene Ligand an allen fünf Subtypen muskarinischer Acetylcholin-Rezeptoren. Zusätzlich zu der orthosterischen Bindungsstelle, an die z. B. Acetylcholin bindet, besitzen muskarinische Rezeptoren auch mindestens eine allosterische Bindungsstelle. Die meisten bekannten Allostere binden an die "common allosteric site". Sind ein Alloster und ein Orthoster gleichzeitig am Rezeptor gebunden, spricht man von einem ternären Komplex. Allosterische Liganden können die Affinität und die intrinsische Aktivität von Orthosteren modulieren. In Radioligandbindungsstudien war der Einfluss zahlreicher allosterischer Modulatoren auf die Bindung des Antagonisten [³H]<i>N</i>-Methylscopolamin ([³H]NMS) untersucht worden. Durch geeignete Allostere ließ sich die Bindung von [³H]NMS entweder erhöhen, erniedrigen oder auch unverändert halten. In funktionellen Experimenten mit dem Partialagonisten Pilocarpin als orthosterischem Liganden hatte sich jedoch gezeigt, dass alle untersuchten Allostere bei unterschiedlicher Beeinflussung der Wirksamkeit von Pilocarpin dessen intrinsische Aktivität verminderten oder ganz aufhoben (Zahn et al., <i>J Pharmacol Exp Ther</i>, <b>301</b>:720-728, 2002; Klemt, Dissertationsschrift, Math.-Nat. Fakultät, Universität Bonn, 2005).<br /> Im Rahmen dieser Arbeit sollte festgestellt werden, ob die intrinsische Aktivität von Acetylcholin ebenfalls empfindlich ist gegenüber einer allosterischen Modulation. Durch Messung der [³⁵S]GTPγS-Bindung an Membransuspensionen aus CHO-Zellen, die stabil mit dem Gen für den humanen M₂-Rezeptor transfiziert waren, wurde der Einfluss strukturell unterschiedlicher allosterischer Modulatoren (u. a. Alkan-bis-Ammoniumverbindungen, Strychnin und Derivate, Caracurine, Alcuronium, Duo3) auf die Wirksamkeit und die intrinsische Aktivität von Acetylcholin am M₂-Rezeptor untersucht. Alle Substanzen führten zu einer Abnahme der Wirksamkeit von Acetylcholin, was sich in einer Verschiebung seiner Konzentrations-Effekt-Kurven zu höheren Konzentrationen zeigte. Bei der Hälfte der allosterischen Modulatoren gab es im untersuchten Konzentrationsbereich Hinweise auf die Bildung ternärer Komplexe. Die maximale Acetylcholin-induzierte G-Protein-Aktivierung blieb jedoch in allen Fällen im Wesentlichen unbeeinflusst. Eine Modulation der Wirksamkeit von Acetylcholin durch Allostere war demnach ohne eine gleichzeitige Veränderung der intrinsischen Aktivität möglich.<br /> Um der Frage nachzugehen, ob die allosterische Senkbarkeit der intrinsischen Aktivität von Pilocarpin eine spezifische Substanzeigenschaft Pilocarpins ist oder ob dies auch bei anderen Partial- oder auch Vollagonisten möglich ist, wurden Carbachol, Oxotremorin, Oxotremorin M (Vollagonisten) und McN-A-343 (Partialagonist) zusammen mit ausgewählten Allosteren in [³⁵S]GTPγS-Bindungsexperimenten eingesetzt. Es zeigte sich, dass die intrinsische Aktivität von McN-A-343 und Carbachol durch die allosterischen Modulatoren ebenfalls vermindert wurde. Das Ausmaß der Reduktion war jedoch geringer als das bei Pilocarpin beobachtete. Die Verminderung der Agonist-induzierten M₂-Rezeptor-vermittelten G-Protein-Aktivierung durch Allostere war demnach nicht nur bei Partialagonisten, sondern auch bei Vollagonisten möglich, trat dort allerdings nicht so häufig auf und war weniger stark ausgeprägt.<br /> Da in den funktionellen Experimenten nicht direkt die Bindung des Agonisten gemessen wurde, sondern die erste Stufe der Rezeptoraktivierung, wurden in Radioligandbindungsstudien [³H]NMS und Acetylcholin bzw. Pilocarpin kompetitiv in An- und Abwesenheit eines Allosters eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die funktionellen Experimente es erlaubten, Affinitätsänderungen von Testsubstanzen zutreffend abzuleiten. Zwischen dem Affinitätsmuster der Allostere am [³H]NMS- und am Acetylcholin-besetzten Rezeptor bestand keine Korrelation. Aufgrund einer Kenntnis der Kooperativität allosterischer Modulatoren mit dem Antagonisten [³H]NMS an muskarinischen Rezeptoren kann demzufolge nicht der Alloster-Effekt auf die Acetylcholin-Affinität vorhergesagt werden. Die Konformationsveränderungen des M₂-Rezeptors bei der Bindung eines Agonisten einerseits und eines Antagonisten andererseits gehen offenbar mit grundlegenden Veränderungen der allosterischen Bindungsstelle einher.