Subtypselektivität allosterischer Liganden an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren

Abstract

Die muskarinischen Acetylcholinrezeptoren gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie besitzen neben der orthosterischen Bindungsstelle für konventionelle Liganden wie Acetylcholin oder N-Methylscopolamin (NMS) eine zweite, allosterische Bindungsstelle, über die allosterische Substanzen die Bindung des orthosterischen Liganden modulieren. Eine gut untersuchte Verbindungsklasse der allosterischen Modulatoren sind die Alkan-Bisammonium-Verbindungen mit dem Prototyp-Modulator W84 [N,N’-Bis[3-(1,3-dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)propyl]-N,N,N’,N’-tetramethyl-1,6-hexan-diammoniumdibromid]. In vorangegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass durch strukturelle Veränderungen von W84 sowohl die Affinität als auch die Kooperativität der Verbindung mit N?Methylscopolamin (NMS) verändert werden können.<br /> Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden weitere strukturelle Modifikationen im Hinblick auf eine Affinitäts- und Kooperativitätsveränderung am M₂-Rezeptor untersucht. Es wurden Radioligandbindungsexperimente mit dem orthosterischen Liganden [³H]N-Methylscopolamin ([³H]NMS) als Sonde an M₂-Rezeptoren aus Hausschweinherzventrikelgewebe durchgeführt (Mg, Tris, Cl, P_i-Puffer: 3mM MgHPO₄, 50mM Tris-HCl; pH 7,3, 37°C). In kinetischen Experimenten wurde die allosterische Verzögerung der Dissoziation von [³H]NMS-Rezeptor-Komplexen untersucht. Der hieraus gewonnene Parameter pEC_0,5diss ist ein Maß für die Affinität des Allosters zu Orthoster-besetzten Rezeptor. Aus [³H]NMS-Gleichgewichtsbindungsexperimenten konnte der Parameter pK_A als Maß für die Affinität des Allosters zum freien Rezeptor sowie der Faktor α der Kooperativität zwischen dem Alloster und NMS ermittelt werden. <br /> Die Untersuchungen zu den strukturellen Veränderungen am W84-Grundgerüst ergaben, dass eine Monomethylierung der Propyl-Seitenkette weder für eine Anhebung der Affinität noch für eine Veränderung der Kooperativität mit NMS im Vergleich zur Ausgangsverbindung ausreichend ist. Lediglich bei den an sich höher affinen Methylphthalimid-Verbindungen führte eine Monomethylierung der Seitenkette zu kleinen Veränderungen der Affinität und einem Anheben der Kooperativität mit NMS auf ein neutrales oder positives Niveau. <br /> Eine Vergrößerung des Seitenkettensubstituenten zeigte, dass eine Substitution mit einem Propyl- bzw. Isobutyl-Rest zu einer signifikanten Steigerung der Affinität führt. Eine Vergrößerung des Methylsubstituenten auf Ethyl brachte hingegen keine Veränderung. Für die Propyl- und Isobutyl-Verbindungen ergaben sich Hinweise auf eine atypische Interaktion mit dem Rezeptor.<br /> Die hochaffine Substanz Naphmethonium, welche einen lateralen Naphthalimidring trägt, fluoresziert. Diese Fluoreszenz kann durch eine Aminierung des Naphthalimids gesteigert werden, was eventuell in zukünftigen Bindungsuntersuchungen ausnutzbar wäre. Die erhobenen Ergebnisse erbrachten, dass sich die Affinitäten zum freien und NMS-besetzten Rezeptor durch die eingeführte Aminogruppe nur marginal verändern. Die positive Kooperativität der Ausgangssubstanz mit [³H]NMS wird hingegen abgeschwächt. Die ebenfalls untersuchten Synthesevorstufen der Verbindung, welche eine Nitrogruppe am Naphthalimid tragen, nehmen auch nur geringen Einfluss auf die Affinitäten, schwächen aber ebenfalls die positive Kooperativität von Naphmethonium mit NMS ab. Eine Verkürzung des Naphmethonium-Grundgerüsts auf die Hälfte des Moleküls führt hingegen zu einem Absinken der Affinitäten um bis zu 2,6 Dekaden und zu neutraler Kooperativität mit NMS. <br /> Eine Verminderung der Flexibilität der W84-Struktur durch Einbringen von 3-fach-Bindungen in die Seitenketten der Substanz hat kaum Auswirkungen auf die Affinität der Verbindung. Die Flexibilität der Seitenketten ist somit nicht essentiell.<br /> In einem zweiten Teil der Arbeit wurden verschiedene strukturveränderte Alkan-Bisammonium-Derivate im Hinblick auf ihre Subtypselektivität an allen fünf Muskarinrezeptoren, gewonnen aus stabil transfizierten CHO-Zellen, untersucht. Es wurde hierbei erstmals die Affinität von W84 zu allen Subtypen bestimmt. Durch Strukturveränderungen, wie Methylierung des Phthalimids, Austausch des Phthalimids gegen ein Naphthalimid und Methylierung der Seitenkette war das Grundgerüst bis hin zum Naphmethonium verändert. Die Reihenfolge der Subtypselektivität folgt bei allen Verbindungen weitgehend folgendem Schema: M₂ > M₁≅ M₄>M₃> M₅. Es konnte gezeigt werden, dass durch die strukturellen Modifikationen von W84 hin zum Naphmethonium vor allem die Spanne der Affinitäten am NMS-besetzten Rezeptor deutlich gesteigert werden konnte. Am freien Rezeptor wurde die Spanne zwar auch vergrößert, jedoch fiel der Gewinn an Subtypselektivität hier nicht so deutlich aus. Eine untersuchte bistertiäre Verbindung zeigte eine reduzierte Affinität zum Subtyp M₂ und somit kaum einen Affinitätsunterschied zwischen M₂ und M₄. Die permanent positiven Ladungen des Moleküls sind somit vor allem für die Affinität zum Subtyp M₂ wichtig. Abschließend wurde mit Hilfe von [³H]NMS-Interaktionsexperimenten die Kooperativität der hochaffinen Substanz Naphmethonium mit dem natürlichen Agonisten Acetylcholin abgeschätzt. Aus vorangegangenen Untersuchungen war bereits bekannt, dass Naphmethonium mit Acetylcholin am M₂-Rezeptor stark negativ kooperativ ist. In der vorliegenden Arbeit konnte sowohl für M₂ als auch für die restlichen muskarinischen Subtypen die Annahme einer stark negativen Kooperativität zwischen Naphmethonium und Acetylcholin bekräftigt werden.