Entwicklung und Validierung von Phänotypisierungsmethoden für die Cytochrom P450-Enzyme CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP2C19 des Menschen

Abstract

Mephenytoin (MEP) wird seit über 20 Jahren standardmäßig zur Phänotypisierung von CYP2C19 eingesetzt. S-MEP wird selektiv durch CYP2C19 zu S-4´-Hydroxymephenytoin (4OHM) metabolisiert. Die renale 4OHM-Ausscheidung reflektiert somit die individuelle Enzymaktivität. Das Hauptziel dieser Dissertation war die systematische Validierung des geeignetsten Urinsammelintervalls hinsichtlich optimaler Sammeldauer, kumulierter oder fraktionierter Sammlung und einer Probenaufarbeitung mit oder ohne beta-Glucuronidase-Vorbehandlung für die selektive und reproduzierbare Aktivitätsbestimmung von CYP2C19 in vivo. Parallel dazu wurde untersucht, ob sich die renale Wiederfindung von N-Desmethylmephenytoin (Nirvanol, NIR) für die in vivo-Phänotypisierung von CYP2B6 eignet. Im Gegensatz zu CYP2C19 und CYP2B6 wurden die Phänotypisierungsmaße für CYP1A2 und CYP2C9 bereits in der Vergangenheit validiert. Die Ermittlung des CYP1A2-Phänotyps erfolgt über den Quotienten der Plasmakonzentrationen von Paraxanthin (PAX) und Coffein (COF) 6 h nach Verabreichung von COF. Zur Aktivitätsbestimmung von CYP2C9 hat sich die 24 h-Plasmakonzentration von Tolbutamid (TOL) etabliert.<br /> 52 Probanden wurden in vier Cocktailphänotypisierungsstudien u.a. mit 50 mg MEP phänotypisiert. Ihr Urin wurde in verschiedenen Intervallen bis zu 166 h nach Verabreichung des Cocktails gesammelt. Zur Quantifizierung von MEP, NIR und 4OHM im Urin wurde eine robuste LC-MS/MS-Messmethode entwickelt und nach internationalen Richtlinien validiert. Um die Messdaten zu verifizieren, wurde ein Großteil der Probanden zusätzlich auf die häufigsten Mutationen der CYP2C19-, CYP2B6- und CYP2C9-Gene untersucht. Zur routinemäßigen CYP1A2- bzw. CYP2C9-Phänotypisierung von Probanden aus Cocktailphänotypisierungsstudien wurde eine LC-MS/MS-Methode zur simultanen Bestimmung von COF, PAX und TOL entwickelt und nach internationalen Richtlinien validiert.<br /> Die eindeutigsten Unterschiede zwischen den einzelnen CYP2C19-Genotypen, sowie die geringste intraindividuelle Variabilität (7% und weniger) ergaben sich für die kumulierte zwölf- bis sechzehnstündige Ausscheidung von 4OHM, kombiniert mit einer beta-Glucuronidasevorbehandlung des Urins. Die renale Eliminierung von NIR wies Halbwertzeiten von mehreren Wochen auf und war – mit Ausnahme einer 2,3-fach höheren Ausscheidungsrate bei einem einzelnen Probanden mit CYP2B6*4/*4-Genotyp – identisch für alle anderen untersuchten Genotypen. Darüber hinaus variierte sie intraindividuell wesentlich stärker (>28% nach 12-stündiger kumulierter Urinsammlung) als für 4OHM.<br /> Die kumulierte renale Ausscheidung von deglucuronidiertem 4OHM bis 12 h nach Verabreichung von 50 mg MEP ist ein empfindliches und reproduzierbares Phänotypisierungsmaß für CYP2C19, bei dessen Anwendung in zukünftigen Interaktionsstudien die geringe Fallzahl von 6 Probanden ausreicht, um den potentiellen inhibitorischen bzw. induktiven Effekt eines Arzneistoffes auf CYP2C19 zu erfassen. Während die prozentuale Wiederfindung von NIR im Urin die Aktivität von CYP2B6 in vivo widerzuspiegeln scheint, stellt sie aufgrund der langsamen Eliminierung und der hohen intraindividuellen Variabilität kein optimales Phänotypisierungsmaß für CYP2B6 dar.