Cisplatin-Resistenz von Tumorzellen

Abstract

Cisplatin ist ein zur Behandlung von vielen Tumoren eingesetztes Zytostatikum. Ein Hauptproblem bei der Chemotherapie mit Cisplatin ist die Resistenzentwicklung der Tumorzellen. Die Mechanismen dieser Cisplatin- Resistenz sind bis heute nicht umfassend aufgeklärt und diese Arbeit sollte einen Beitrag zur Aufklärung noch nicht bekannter Resistenzmechanismen leisten. Ausgehend von der Zungenkarzinom-Zelllinie Cal27 war es möglich, eine 10fach Cisplatin-resistente Subzelllinie (Cal27res) zu etablieren. Die Genexpression dieser beiden Zelllinien wurde mittels der PCR-basierten Subtraktionshybridisierung (SSH) nach einer Behandlung der Zelllinien mit 10 XM Cisplatin – maximalen Plasmaspiegeln - verglichen. Um die normalerweise recht große Anzahl falsch-positiver Ergebnisse dieser Methode zu minimieren, wurde die SSH ergänzt durch zwei weitere Methoden: <em>Mirror orientation selection </em>(MOS) und einem differentiellen Screening.<br /> So konnten mittels SSH fünf Kandidatengene identifiziert werden, die nach Cisplatin-Behandlung unterschiedlich zwischen Cal27res und der Cal27 exprimiert wurden. Dies waren Aldo-Keto-Reduktase AKR1B1, Cystatin A (CSTA), der Wnt-Inhibitor Dickkopf 1 (DKK1), das ribosomale Protein 5 der großen Untereinheit (RPL5) und Thrombospondin-1 (THBS1). Bis auf RPL5 konnte für diese Gene die differentielle Expression mittels qRT-PCR zwischen Cal27 und Cal27res bestätigt werden. Um einen besseren Einblick zu bekommen, ob diese Gene Teil einer allgemeingültigen Reaktion von Tumorzellen auf die Behandlung mit Cisplatin sind, wurden neben den beiden Cal27-Zelllinien weitere 16 Tumorzelllinien mittels qRTPCR untersucht. Alle Zelllinien wurden vergleichbaren Cisplatinkonzentrationen ausgesetzt, nachdem die Cisplatin-sensitivität aller Zelllinien gegenüber Cisplatin mittels MTT-Test analysiert worden war. Nach einer 24stündigen Behandlung jeder Zelllinie mit der 1-2fachen EC₅₀ von Cisplatin und einer 48stündigen Auswaschphase wurde die Expression der SSH-Kandidatengene und weiterer interessanter Gene (AKR1C1/2, CTSB, EGR1 und p53) mittels qRT-PCR untersucht. Als Kontrolle wurde von jeder Zelllinie ebenfalls RNA einer unbehandelten Probe gewonnen. Um die mittels PCR untersuchten Zelllinien untereinander vergleichen zu können, stellte sich die Frage nach einer geeigneten Normierung der qRT-PCRDaten. Die zuvor angewendete Methode von Vandesompele et al. (Genome Biol. 2002), als geNorm publiziert, schien bei einer solch großen Datenmatrix als weniger geeignet. Alle 36 Proben, hervorgegangen aus 18 verschiedenen Zelllinien mit je zwei verschiedenen Behandlungen, hätten auf wenige, für alle Proben identische interne Standardgene (HKGs) normiert werden müssen. Generell ist jedoch das Expressionsmuster der als potentiellen HKGs eingesetzten Gene in dieser Vielzahl untersuchter Gewebe sehr verschieden. Daher wurde eine neue Methode der Auswertung (NormIt) entwickelt, die, bezogen auf das generelle Expressionsmuster der potentiellen HKGs, über alle untersuchten Proben für jede Probe geeignete HKGs auswählt. Über diese HKGs können die ursprünglich gemessenen CT-Werte normalisiert werden. Dies erlaubt den absoluten Vergleich der Genexpressionen zwischen den Zelllinien, jedoch steht die endgültige Validierung dieses Verfahrens noch aus.<br /> Interessante Ergebnisse zeigten sich in dieser PCR-Genexpressionsstudie vor allem für die beiden Kandidatengene THBS1 und DKK1 sowie für das Gen EGR1. THBS1 zeigt in fast allen Zelllinien eine signifikante Induktion auf Cisplatin-Behandlung, besonders in Cal27 und den beiden A2780- Zelllinien. DKK1 wird nicht einheitlich auf Cisplatin-Behandlung von den verschiedenen Zelllinien reguliert, aber vor allem Cal27 zeigt eine deutliche Induktion, Cal27res dagegen nicht. EGR1 wird vor allem von den beiden A2780-Zelllinien auf Cisplatin-Behandlung induziert, andere Zelllinien reagieren aber z. T. auch mit einer Herabregulierung.<br /> Für den Wnt-Antagonisten DKK1 war es möglich, einen ELISA zu etablieren. Dieser zeigte für Cal27 auf Proteinebene eine etwa 2-3fach gesteigerte Sezernierung von DKK1 gegenüber der Cisplatin-resistenten Subzelllinie Cal27res. Eine stabile Überexpression von DKK1 führte zu etwa 2fach Cisplatin-sensitiveren Klonen sowohl von Cal27 als auch von Cal27res. Dies konnte mittels eines Zytotoxizitäts-Test (MTT-Test) als auch eines Proliferations-Test (BrdU-Test) gezeigt werden. Eine Behandlung der Zellen mit Cisplatin führte zu einer gesteigerten DKK1- Sekretion. Inwieweit dies jedoch Cisplatin-spezifisch ist, bedarf weiterer Untersuchungen. Weitere Stressstimuli wie Serumentzug oder auch andere Zytostatika scheinen eine verstärkte DKK1-Sekretion hervorzurufen. <br /> In dieser Arbeit konnten neue Kandidatengene der Cisplatin-Resistenz identifiziert und ihre Expression mittels PCR an 18 Zelllinien ohne und mit Cisplatin-Behandlung verglichen werden. DKK1 wurde weitergehender untersucht und die Ergebnisse zeigen, dass der Wnt/ß-Catenin-Signalweg ein Ansatzpunkt sein könnte, um generell das Ansprechen von Tumoren auf die Behandlung mit Zytostatika zu sensitivieren.

Cisplatin is used for the treatment of various types of cancer. One of the major problems in chemotherapy is the occurance of drug resistance. Up until today, the mechanisms of resistance still aren’t clearly understood. In the differential gene expression study we managed to establish an about 10-fold cisplatin resistant subcell line of 27 (Cal27res). Gene expression analysis of both cell lines by PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) was performed after treatment of cell lines with 10 XM Cisplatin. This concentration corresponds to achievable plasma levels of cisplatin. A major drawback of SSH is the occurrence of falsepositive results. To reduce this background, two further methods were performed: mirror orientation selection (MOS) and differential screening.<br /> Five candidate genes could be identified by SSH which were differentially regulated between the cisplatin sensitive parental cell line Cal27 and its cisplatin resistant subcell line Cal27res. The genes identified were Aldoketo- reductase AKR1B1, cystatin A (CSTA), the Wnt inhibitor DKK1, the ribosomal protein of large subunit 5 (RPL5) and the angiogenesis inhibitor thrombospondin-1 (THBS1). For all genes except for RPL5 the differential gene expression could be verified by qRT-PCR. Another gene expression study of Cal27 cell lines and 16 other tumour cell lines was carried out to examine whether differential gene expression of these candidate genes is part of a general reaction of cells following cisplatin treatment. Initially cisplatin sensitivity of all cell lines was examined by MTT assay. After the cell lines had been treated with cisplatin (1 to 2-fold EC₅₀ for 24 h; washout 48 h) gene expression of the SSH candidate genes and some other interesting genes (AKR1C1/2, CTSB, EGR1 and p53) was analyzed by qRT-PCR. Treated cells were compared to their untreated controls. <br /> For the comparison of gene expression between all 18 cell lines, an adequate normalization method for qRT-PCR had to be found. The method published by Vandesompele et al. (Genome Biol. 2002) seems to have disadvantages comparing such a big sample pool. All 36 samples of 18 different cell lines had to be normalized with the most stable genes from a panel of potential housekeeping genes (HKGs). However, the examined tissues differ in the expression pattern of these genes. Thus, we established a new method (NormIt). Referring to the general expression pattern of all samples, NormIt selects adequate HKGs for each sample. Applying this method it is possible to normalize measured C_T-values for direct comparison of gene expression between different cell lines, but a validation is still missing.<br /> The SSH candidate genes THBS1 and DKK1 and EGR1 showed interesting qRT-PCR results. THBS1 presents a significant induction of gene expression after cisplatin treatment, especially in Cal27, in A2780 and A2780cis. The expression of DKK1 after cisplatin incubation is not consistent in the different cell lines. Mainly in Cal27 its gene expression is clearly induced, but not so in Cal27res where DKK1 is not regulated. The gene expression of EGR1 is highly induced in both A2780 cell lines, whereas in some other cell lines it is down regulated. Further on an ELISA was established for the Wnt antagonist DKK1. The secretion of DKK1 in Cal27 compared to the cisplatin resistant sub cell line Cal27res was increased by 2 to 3-fold as detected on protein level. Stable overexpression of DKK1 caused a 2-fold increased sensitivity against cisplatin compared to its parentel cell lines as shown by the cytotoxicity assay MTT and the proliferation assay BrdU. Treatment of Cal27 cells with cisplatin caused an induction of DKK1 secretion. It has to be further examined if this effect is cisplatin specific. First experiments hypothesized that the secretion of DKK1 is also influenced by stress stimuli such as serum starvation and incubation with different cytostatic drugs. In this study it was possible to identify new candidate genes for cisplatin resistance. Their gene expression was measured by qRT-PCR. Further investigations on DKK1 identified DKK1 to be a target to sensitize tumors to cytostatic drugs.