Herkunftsbestimmung ausgewählter urinärer Steroide anhand des Kohlenstoffisotopenverhältnisses

Abstract

In der Europäischen Union ist die Anwendung von Stoffen mit hormonaler Wirkung als Wachstumsförderer in der Tiermast aufgrund möglicher Gesundheitsrisiken für den Verbraucher verboten. Im Sport gilt die Anwendung anaboler Steroide als Doping. <br /> Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden zum einen für den Nachweis der missbräuchlichen Anwendung von Testosteron und Estradiol in der Rindermast und zum anderen für die Bestimmung der endogenen oder exogenen Herkunft urinären Norandrosterons in Dopingkontrollproben, um Doping von physiologischen Ursachen zu unterscheiden. <br /> Während sich der Nachweis der missbräuchlichen Anwendung xenobiotischer Stoffe wie z.B. Clenbuterol durch massenspektrometrische Verfahren relativ einfach darstellt, bedarf es für den Nachweis des Missbrauchs natürlicher Steroide wie Testosteron einer anderen Strategie. Steroide werden zumeist aus C₃-Pflanzen durch Partialsynthese hergestellt und weisen ein relativ niedriges ¹³C/¹²C-Verhältnis auf. Endogene Steroide hingegen weisen weniger abgereicherte Kohlenstoffisotopenverhältnisse auf, da der Körper sie aus der Nahrung herstellt, welche in aller Regel ein Gemisch aus C₃- und C₄-Pflanzen darstellt. Entsprechend basieren die entwickelten Methoden auf dem Einsatz der komponentenspezifischen Isotopenverhältnismassenspektrometrie des Kohlenstoffs (GC/C/IRMS). <br /> Für die Rindermethode wurden zunächst geeignete Zielanalyten anhand der quantitativen Analyse urinärer Steroide vor und nach Applikation von Testosteron und Estradiol ermittelt. Als endogene Referenzverbindungen (ERCs) wurden Dehydroepiandrosteron und Androst-5en-3β,17α-diol gewählt, da sich deren Konzentration unabhängig von den getesteten Applikationen darstellte. Etiocholanolon und zwei Androstandiole wurden als wichtigste Testosteron-Metaboliten identifiziert, während andere literaturbekannte Steroide wie Epiandrosteron und Epitestosteron weniger Erfolg versprechend waren. 17α-Estradiol war der einzige interessante Metabolit des verabreichten 17βEstradiols. <br /> Grundvoraussetzung für verlässliche GC/C/IRMS-Messungen ist die Basislinientrennung zwischen den Analyten und der biologischen Matrix. Da Rinderurin eine komplexe Matrix mit nur geringer Konzentration der Zielanalyten darstellt, wurde eine entsprechend aufwändige Probenaufarbeitung, u.a. basierend auf zwei aufeinander folgenden semipräparativen HPLC-Reinigungsschritten entwickelt. <br /> Anhand der Analyse des Kohlenstoffisotopenverhältnisses der Zielanalyten aus dem Urin unbehandelter Tiere wurden Vertrauensintervalle für die Differenzen der sog. δ¹³C_VPDB-Werte zwischen ERCs und Metaboliten entwickelt. Der Vergleich der ermittelten Differenzen mit den Vertrauensintervallen führte in keiner Probe eines unbehandelten Tiers zu einem falsch positiven Befund. Der Nachweis der Testosteron-Gabe anhand der Vertrauensintervalle gelang bei Ochsen und weiblichen Rindern bis zu 44 Tagen nach Applikation. Bei Bullen gelang dieser Nachweis aufgrund der vergleichsweise hohen Steroidbiosynthese in der Regel nicht. Die Wahrscheinlichkeit eines Missbrauchs von Testosteron bei nicht kastrierten männlichen Rindern ist allerdings aufgrund mangelnder Rentabilität im Vergleich zu den anderen Tieren am geringsten. Der Nachweis des Missbrauchs von Estradiol anhand der Vertrauensintervalle gelang bei Ochsen, Bullen und weiblichen Rindern bis zu 3 Wochen nach Applikation. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die entwickelte Methode geeignet ist, die endogene oder exogene Herkunft der identifizierten Metaboliten von Testosteron und Estradiol zu bestimmen und somit deren missbräuchliche Anwendung in der Rindermast aus dem Urin nachzuweisen. <br /> 19-Norandrosteron ist der wichtigste Metabolit des synthetischen Nandrolons oder seiner Prohormone. Ein Dopingverstoß galt bislang als erwiesen, wenn eine urinäre Konzentration von 2 ng/mL, ggf. nach Ausschluss einer Schwangerschaft oder der Einnahme bestimmter Kontrazeptiva, überschritten wurde. Jüngste Erkenntnisse zeigten jedoch, dass Norandrosteron in sehr seltenen Fällen aufgrund einer bislang wenig erforschten Demethylierungsaktivität noch im Urin aus dem natürlichen Androsteron gebildet werden kann. <br /> Entsprechend war das zweite Ziel dieser Arbeit die Entwicklung einer Methode, welche die verlässliche Ermittlung der ¹³C/¹²C-Verhältnisse von Norandrosteron mit ggf. exogener Isotopensignatur und Androsteron als ERC aus dem Humanurin ermöglicht. Es konnte weitgehend die gleiche Aufreinigungsprozedur wie für den Rinderurin angewendet werden. Die entwickelte Methode ermöglicht die spezifische Bestimmung der ¹³C/¹²C-Verhältnisse von Norandrosteron, Androsteron sowie Etiocholanolon mittels GC/C/IRMS. Der δ¹³C_VPDB-Wert eines zu Leerurinen zugesetzten Norandrosteron-Standards wurde unabhängig von seiner Konzentration bis hinunter zum Grenzwert von 2 ng/mL wiederholbar bestimmt. In Kontrollproben wurde die bekannt endogene oder exogene Herkunft des Norandrosterons anhand des Vergleichs mit Androsteron als ERC richtig bestimmt. Die Analyse von Dopingkontrollproben mit nachgewiesener Demethylierungsaktivität zeigte für Norandrosteron und Androsteron weitgehend identische δ¹³C_VPDB-Werte, woraus geschlossen wurde, dass diese Reaktion mit keinem deutlichen Isotopeneffekt für das Norandrosteron behaftet ist. Die Anwendung der entwickelten Methode auf Dopingkontrollproben ermöglichte die eindeutige Bestimmung der endogenen oder exogenen Herkunft des urinären Norandrosterons.