Optimierte Analyse von Flavonoiden mit HPLC-MS

Abstract

Polyphenole sind Sekundärmetaboliten und meist Minorkomponenten von Pflanzen und spielen eine Rolle unter anderem als UV- und Fraßschutz, Schutz vor Pilzbefall und als Allelochemikalien. Die Lebensmittelqualität und -technologie beeinflussen sie durch ihre Farbe, Adstringenz und ihre antioxidativen und proteinbindenden Eigenschaften. Zahlreiche Studien wiesen positive physiologische Wirkungen von Polyphenolen nach und bringen ihre Aufnahme mit der Nahrung in Zusammenhang mit einem verminderten Risiko für z.B. kardiovaskuläre Erkrankungen oder Krebs.<br /> Grundlage der Erforschung technologischer oder gesundheitlicher Wirkungen ist eine profunde Analytik der Polyphenole, die eine schonende Konzentrierung und Abtrennung von der Matrix, eine hochauflösende Trennung und eine selektive und empfindliche Detektion umfasst. Die geringen Konzentrationen, die komplexen Matrices, ihre große Strukturvielfalt und Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff, Wärme, Licht und Hydrolyse, sowie der Mangel an kommerziell verfügbaren Standards von ausreichender Reinheit erschweren die Untersuchungen.<br /> Ziel der Arbeit war deshalb eine leistungsstarke, optimierte und automatisierte Analytik von Polyphenolen mittels Hochleistungsflüssigchromatographie und Ionenfallen-Massenspektro­metrie. Dafür wurden die beschleunigte Lösungsmittel­extraktion (PLE), Festphasenextraktion (SPE), Hochleistungsflüssig­chromatographie (HPLC), Ultraviolett-Diodenarraydetektion (UV-DAD) und Massen­spektrometrie (MS) detailliert untersucht, adaptiert, automatisiert und beschleunigt sowie miteinander gekoppelt. Die optimierten Methoden erlauben eine weitgehend automatisierte, schnelle Analytik individueller Polyphenole in einer großen Zahl von Proben in weniger Arbeitsschritten mit einem deutlich verringerten manuellen Arbeitsaufwand und geringerem Verbrauch an Lösungsmitteln als die bisher genutzten Verfahren. Die methodische Entwicklung, Etablierung und Nutzung dieser Kopplungstechnik erfolgte hier erstmalig für die lebensmittelchemische Analytik.<br /> Mit der entwickelten Methode wurden 41 einzelne Flavonoide, hydrolysierbare Tannine und Phenolcarbonsäuren in Johannisbrot (<em>Ceratonia siliqua</em> L.) und -produkten zum ersten Mal identifiziert, strukturell beschrieben und quantifiziert. In Gerstenmalz (<em>Hordeum vulgare </em>L.) wurden 58 bisher dort nicht strukturell beschriebene Proanthocyanidine, 21 Flavanolglykoside und ein glykosyliertes dimeres Proanthocyanidin erstmals identifiziert. 4-6 Verknüpfungen und verzweigte Verbindungen sowie (epi)Afzelechin als Monomer der Proanthocyanidine im Malz wurden nachgewiesen. Durch Anwendung der massenspektrometrischen Quantifizierung kann die Vielfalt individueller, strukturell verwandter Verbindungen neben den Hauptproanthocyanidinen die analytischen Möglichkeiten für die Authentizitäts- und Herkunftsbestimmung anhand der Polyphenolmuster erweitern, auch in anderen pflanzlichen Produkten. In Hopfen wurden bisher dort nicht beschriebene höher prenylierte Flavonoide, sowie in der Alkyl-Seitenkette modifizierte Humulone und Lupulone identifiziert.<br /> Die Veränderungen der Konzentrationen einzelner Polyphenole in Prozessproben aus der Brauerei und aus der Johannisbrotverarbeitung wurden untersucht, um einen bisher nicht erreichten detaillierten Einblick in den Prozess und seine Auswirkungen auf einzelne, unterschiedliche Substanzen zu gewinnen. Daraus lassen sich wertvolle Informationen für die Verarbeitung dieser Lebensmittel ableiten, um die Gehalte und das Muster der enthaltenen Polyphenole durch entsprechende Prozessführung gezielt zu steuern und die kostenintensive PVPP-Filtration des Bieres vor der Abfüllung bei Kenntnis des Konzentrationsverlaufes einzelner trübungsaktiver Proanthocyanidine zu optimieren.<br /> Für die eingehende Untersuchung technologischer oder gesundheitlicher Wirkungen müssen neben der genauen Analyse auch reine Einzelsubstanzen verfügbar sein. Das kommerzielle Angebot für strukturell komplexe Polyphenole, insbesondere für Proanthocyanidine, ist allerdings sehr gering. Daher wurden die eingesetzten Analyseschritte in ihrem Verhalten gegenüber verschiedenen Substanzen charakterisiert und die Eignung für eine präparative Arbeit erprobt. Erfolgreich wurden Xanthohumol und 8-Prenylnaringenin aus Hopfen als Reinsubstanzen isoliert und anschliessend als Referenzverbindung zur Entwicklung einer chiralen Trennung mittels Kapillarelektrophorese eingesetzt. Die Proanthocyanidine aus Gerstenmalz wurden im präparativen Maßstab nach ihrem Oligomerisationsgrad fraktioniert und die so gewonnenen hochkonzentrierten Misch-Standards erfolgreich in der analytischen Methodenentwicklung eingesetzt. Sie bieten aber auch den Ausgangspunkt für detaillierte Untersuchungen zur Abhängigkeit der Trübungsaktivität von der Struktur.<br /> Die entwickelten Analysenmethoden wurden auch für die Untersuchung von Polyphenolen verschiedener Substanzgruppen im Rahmen weiterer Untersuchungen unter anderem in Zitrusfrüchten, Açai-Früchten (<em>Euterpe Oleracea Mart.</em>), Camu-Camu (<em>Myrciaria dubia (H.B.K.) Mc Vaugh</em>), Tamarillo (<em>Cyphomandra betacea</em>), Guaraná (<em>Paullinia cupana</em>), Tee- und Kakaoextrakten, Trauben- und Apfelsäften angewendet.

<strong>Optimized Analysis of Flavonoids by HPLC-MS</strong><br /> Polyphenols are secondary metabolites found usually as minor constituents in plants and serve as allelo-chemicals and as a protection against ultraviolet light, herbivores, and several plant pathogens. In food quality and technology, their color, astringency, and antioxidative and protein precipitative properties are of considerable interest. Several studies revealed a beneficial physiological action of flavonoids and related substances and showed a correlation of their nutritional intake and a reduced risk to develop e.g. cardiovascular diseases or cancer.<br /> An analytical methodology comprising careful concentration and purification as well as a high performance separation and selective and sensitive detection is the key to the investigation of technological and health related properties of individual polyphenols, because the analysis is often impaired by small concentrations, the complex matrices, their structural diversity, and their susceptibility to oxygen, light, elevated temperature, and acidic or basic conditions. Furthermore, reference compounds of suitable purity are only available in a few cases.<br /> Therefore, the aim of this work was a powerful, optimized and automated analysis of polyphenols using high performance liquid chromatography and ion trap mass spectrometry. Accelerated Solvent Extraction (ASE), solid phase extraction (SPE), high performance liquid chromatography (HPLC), ultraviolet diode array detection (UV-DAD), and mass spectrometry (MS) were investigated in detail, modified, automated, and coupled to meet these needs. This enables a rapid analysis with a reduced consumption of solvents, requiring less steps and markedly reduced manual work compared to previous procedures. This allows the sensitive and reproducible analysis of individual polyphenols in a high number of process samples and is able to quantify even small changes in their concentrations. The method development, implementation and usage of this coupling technique in the present work is a first for food chemical analysis.<br /> The analytical procedure was used to identify, structurally characterize, and quantify 41 flavonoids, hydrolyzable tannins and phenolic acids in carob (<em>Ceratonia siliqua</em> L.) and derived products for the first time. In barley malt (<em>Hordeum vulgare</em> L.), 58 different proanthocyanidins, 21 flavanolglycosides, and one glycosylated dimeric proanthocyanidin were structurally described for the first time in malt. 4-6 linked and branched proanthocyanidins were identified and (epi)afzelechin confirmed to occur as a proanthocyanidin building block in malt. By employing the advantages of mass spectrometric quantitation, this structural diversity of compounds could possibly be used in addition to the main proanthocyanidins to certify the authenticity, in malt as well as in other plant derived sample material. Previously not described higher prenylated flavonoids as well as humulones and lupulones, modified in the alkyl side chain, were identified in hops in this work.<br /> Samples from carob pod processing and from the beer brewing process were analyzed for concentration changes of individual polyphenols to gain insight into the process and its influence on different compounds in far more detail than previously possible. Valuable information for food processing control can be derived from these data, to optimize specific influences on the pattern and content of polyphenols and the cost-intensive filtration of beer with PVPP with the knowledge of the changes in the concentrations of single haze-active proanthocyanidins.<br /> Pure single compounds are needed for the detailed investigation of technological or physiological effects as well as for the analysis itself. Only a few reference compounds are commercially available in sufficient purity, and especially structurally complex substances like proanthocyanidins are very rare. The different steps of the analytical procedure were therefore characterized in view of their ability to serve for an isolation and purification strategy. Xanthohumol and 8-prenylnaringenin were successfully isolated and purified from hops and used as reference compounds for the chiral separation with capillary electrophoresis. The proanthocyanidins from barley malt were separated according to their degree of oligomerization in the preparative scale. The high concentrated standards were used in analytical method development. They could as well be used for detailed studies of the structure activity relationship regarding their protein precipitative or other properties.<br /> The versatility of the developed analytical procedures enabled the investigation of different flavonoids also in several further studies of citrus fruits, açai (<em>Euterpe Oleracea Mart.</em>), camu-camu (<em>Myrciaria dubia (H.B.K.) Mc Vaugh</em>), tamarillo (<em>Cyphomandra betacea</em>), guaraná (<em>Paullinia cupana</em>), tea and cocoa extracts, and grape and apple juices.