Untersuchungen zu Bindeproteinen, funktioneller Modifikation und subzellulärer Lokalisation von Connexinproteinen

Abstract

Das Gap Junction-Protein Connexin45 (Cx45) kann interzelluläre Kanäle ausbilden und wird unter anderem in Gehirn, Herz und Interneuronen der Retina der adulten Maus exprimiert. Sein Fehlen führt zu einer embryonalen Lethalität aufgrund einer pericardialen Effusion, was auf die wichtige Rolle des Proteins in der embryonalen Herzentwicklung der Maus hinweist.<br /> In dieser Doktorarbeit wurde nach Bindeproteinen gesucht, die an die zytoplasmatischen Domänen dieses Connexins binden oder diese posttranslational modifizieren, um so die Bedeutung des Connexins für Signalwege, den intrazellulären Transport sowie der Regulationen der Kanalfunktion zu charakterisieren. Es wurden zunächst mehrere Kandidatenproteine bearbeitet und schließlich das golgiständige Bindeprotein „Gorasp2“ näher untersucht. Dessen Bindung an den Carboxyterminus des Cx45 Proteins konnte sowohl im Hefe-Zwei-Hybrid-System als auch in unterschiedlichen biochemischen Bindeexperimenten nachgewiesen werden. Die Assoziation des Proteins mit Cx45 wurde in verschiedenen Zelllinien getestet. Vorläufige Analysen deuten darauf hin, dass eine Interaktion vorliegen könnte, die zum Transport des Connexins in einigen Zelltypen beiträgt.<br /> Zur Strukturaufklärung des Carboxyterminus des Cx45 und einem besseren sterischen Verständnis möglicher Proteinbindungen wurden Experimente durchgeführt um durch eine NMR (Nuclear Magnetic Resonanz)- Analyse die dreidimensionale Struktur dieser Domäne aufzuklären. Die Messergebnisse an dem 15N markierten reinen Peptid deuten auf eine weitgehend relaxierte Struktur hin. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die lichtabhängige Phosphorylierung des Connexin36 (Cx36)-Proteins in AII Amakrin Zellen in der Retina der Maus untersucht: Es gelang der Nachweis, dass die Serinreste S110 und S293 der intrazellulären Domänen dieses Proteins abhängig von der intrazellulären Konzentration von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) phosphoryliert werden. Dies führt zu einer Verminderung der Cx36-vermittelten Gap Junction-Kopplung zwischen diesen Zellen und moduliert so die Anpassung der Retina an veränderte Lichtverhältnisse.<br /> Schliesslich wurde eine Maus, die das verstärkt grün fluoreszierende Protein (eGFP) als Fusionsprotein mit Cx45 transgen exprimiert, hinsichtlich dessen Lokalisation in der Retina untersucht. Die Fluoreszenzsignale in der Mausretina weisen auf eine Lokalisation des Proteins hin, die der des endogenen Cx45 entspricht, was eine subzelluläre Analyse der Lokalisation in verschiedenen Zelltypen ermöglicht.