Charakterisierung der Expression und proliferativen Wirkung von muscarinischen Rezeptoren in Lungenfibroblasten

Abstract

<p>Chronische inflammatorische und obstruktive Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD gehen in ihrer Entwicklung und in ihrem Verlauf mit Umbau- und Remodelling-Prozessen einher. In der Therapie dieser Erkrankungen sind Anticholinergika wie der muscarinische Antagonist Tiotropium Mittel der Wahl und haben einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Dieses lässt darauf schließen, dass cholinerge Mechanismen an den strukturellen Veränderungen beteiligt sind. Neben endogen freigesetztem Acetylcholin spielen auch weitere Mediatoren wie z. B. Wachstumsfaktoren eine wesentliche Rolle. Die strukturellen Veränderungen im Rahmen des Remodelling-Prozess betreffen Epithel, Blutgefäße, Drüsen, glattes Muskelgewebe und Bindegewebe gleichermaßen. So haben auch Fibroblasten einen erheblichen Anteil an diesen Umbau-Vorgängen. Die Wirkung cholinerger Mechanismen auf das Verhalten der Fibroblasten wurde noch nicht genauer untersucht.<br /> In diesem Projekt sollte daher zunächst eine gerichtete Charakterisierung der fünf muscarinischen Rezeptoren M1 bis M5 in primären Fibroblasten aus der Trachea der Ratte und in den humanen Fibroblasten-Zelllinien MRC-5, IMR-90 und HEL-299 durchgeführt werden. Bei der Untersuchung der mRNS-Expression dieser Rezeptoren mittels semi-quantitativer RT-PCR ergab sich folgendes Expressionsmuster: mRNS für M2-Rezeptoren war sowohl bei den unpassagierten als auch bei Passage 3 der Fibroblasten der Ratte in Spuren vorhanden, die mRNS-Expression für M3 war bei den verschiedenen Proben sehr variabel und mRNS für M1, M4 und M5 konnte nicht nachgewiesen werden. Die humanen MRC-5-Fibroblasten exprimieren am stärksten für M2 kodierende mRNS, gefolgt von mRNS für M3 und M4. M5-mRNS war lediglich in Spuren und M1-mRNS nicht vorhanden. Auch die Fibroblasten der Zelllinien IMR-90 und HEL-299 zeigten die stärkste mRNS-Expression für den M2-Rezeptor, gefolgt von Transkripten für M4. Sehr deutlich abgestuft hierzu war die mRNS-Expression für M3 und M5, Transkripte für M1 konnten nicht nachgewiesen werden.<br /> Die funktionelle Bedeutung dieser Rezeptoren wurde bestimmt, indem der Effekt der cholinergen Agonisten Carbachol und Oxotremorin auf die 3H-Thymidin-Inkorporation und damit auf die Proliferation der Fibroblasten geprüft wurde. Ein proliferationssteigernder Effekt durch muscarinische Stimulation konnte bei den Fibroblasten der Ratte lediglich in Anwesenheit einer submaximalen Konzentration (1%) von fetalem Kälberserum (14%±7% durch Carbachol, P>0,5; 18%±12% durch 1 µM Oxotremorin, P<0,01) oder in Anwesenheit der Wachstumsfaktoren PDGF (73%±38% durch 1 µM Carbachol, P<0,01) oder IGF-1 (21%±12% durch 1 µM Carbachol, P>0,05) festgestellt werden.<br /> Eine proliferationsstimulierende Wirkung muscarinischer Agonisten auf die humanen MRC-5-Fibroblasten konnte auch ohne den Einfluss weiterer mitogener Faktoren festgestellt werden. Bei einer Inkubationszeit der Fibroblasten mit den Testsubstanzen unter FKS-freien Bedingungen über 24 h betrug sie 38%±18% bei 10 µM Carbachol (P<0,01). Bei einer Einwirkzeit der Testsubstanzen über 48 h unter FKS-freien Versuchsbedingungen lag die Steigerung des Zellwachstums durch 10 µM Carbachol bei 52%±10% (P<0,01) und durch 10 µM Oxotremorin bei 61% (P<0,01). Diese stimulierenden Effekte konnten durch die muscarinischen Antagonisten Atropin und Tiotropium verhindert werden. Wurden die Testsubstanzen unmittelbar nach der Zellaussaat unter FKS-freien Versuchsbedingungen über 48 h zugefügt, konnte eine Stimulation der Proliferation um 64%±8% durch 10 µM Carbachol (P<0,01) und um 100%±26% durch 10 µM Oxotremorin (P<0,001) beobachtet werden. Auch diese Steigerung der Proliferation war Atropin-sensitiv.<br /> Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass Lungenfibroblasten der Ratte wie auch der humanen Zelllinien muscarinische Rezeptoren exprimieren, deren Aktivierung zu einer Steigerung der Proliferation dieser Zellen führt. Bei den Fibroblasten der Ratte ist für eine Stimulation des Zellwachstums vermutlich die Anwesenheit weiterer mitogener Faktoren wie z. B. von Wachstumsfaktoren notwendig. Dieser proliferative Effekt scheint Anteil an den strukturellen Veränderungen zu haben, die bei chronischen inflammatorischen und obstruktiven Atemwegserkrankungen eine Rolle spielen. Der positive Einfluss, den Anticholinergika wie Tiotropium auf den Verlauf dieser Erkrankungen haben, könnte durch eine langfristige Blockade der muscarinischen Rezeptoren erklärt werden.</p>