Klonierung, Amplifikation und Charakterisierung eines rekombinanten adenoviralen Vektors zur Transduktion muriner dendritischer Zellen für die AFP-spezifische Immuntherapie des hepatozellulären Karzinoms

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom ist eine häufige Tumorerkrankung mit schlechter Prognose. In Deutschland ist mit über 3 000 Erkrankungsfällen jährlich zu rechnen, bei steigenden Fallzahlen. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt insgesamt lediglich 10%, was in den unzureichenden kurativen Therapieansätzen begründet ist. Chirurgische oder lokoregionäre Maßnahmen können in einem Teil der frühzeitig diagnostizierten Fälle zu einer definitiven Ausheilung führen. Immuntherapeutische Maßnahmen haben in klinischen Studien bei Patienten nach kurativer Resektion zu einer Verbesserung der Prognose geführt. Eine Optimierung dieser Therapiestrategien könnte auch zu einer erfolgreichen Behandlung von Patienten beitragen, welche aufgrund ihres Tumorstadiums für die Resektion nicht mehr in Betracht kommen. Einer der verfolgten immunologischen Therapieansätze ist die Induktion einer Alpha-Fetoprotein (AFP)-spezifischen Immunantwort mittels Durchbrechung der Immuntoleranz gegen AFP durch manipulierte dendritische Zellen. In vitro-Daten zeigen, daß mit einem AFP-rekombinanten adenoviralen Vektor transduzierte dendritische Zellen eine potente und spezifische Immunantwort induzieren können. Tierversuche sind jedoch vor der Durchführung von Therapieerprobungen im Menschen in vivo unabdingbar. <br /> Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung eines adenoviralen Vektors, welcher für murines Alpha-Fetoprotein (mAFP) kodiert, die Generierung von dendritischen Zellen aus dem Knochenmark von Mäusen sowie die Transduktion derselben mit dem erwähnten Vektor mit dem Ziel, die Immuntoleranz gegenüber mAFP zu durchbrechen. Zudem werden, anhand eines GFP-kodierenden adenoviralen Vektors, verschiedene Strategien erprobt und verglichen, um die Transduktion der dendritischen Zellen zu verbessern. Es wird gezeigt, daß der klonierte Vektor dosisabhängig zu starker mAFP-Expression in Zielzellen führt. Die aus Knochenmark gewonnen Zellen weisen den Phänotyp von dendritischen Zellen auf und reifen nach entsprechender Stimulation in typischer Weise aus. Die Transduktionsraten der dendritischen Zellen können durch ein Zentrifugationsverfahren oder durch vorherige Stimulation oder durch eine Kombination der genannten Faktoren erheblich gesteigert werden. Es wird ferner gezeigt, daß dendritische Zellen, welche mit dem mAFP-rekombinanten adenoviralen Vektor transduziert wurden, murines Alpha-Fetoprotein exprimieren. Die Daten weisen weiterhin daraufhin, daß mAFP zu einer reduzierten Ausreifung der dendritischen Zellen führt, gemessen an der Expression von kostimulatorischen Markern. Diese Beobachtung steht in Einklang mit bereits publizierten Berichten, welche AFP eine immunsuppressive Rolle zuschreiben.<br /> Die dargestellten Arbeiten bildeten die Grundlage für die Untersuchung der Induktion einer mAFP-spezifischen zellulären Immunantwort in vitro und im weiteren Verlauf für die Erprobung der Wirkung von kostimulatorischen Signalen auf die Induktion einer mAFPspezifischen zellulären Immunantwort in vitro und in vivo.