Das Aktinzytoskelett-Protein Myotilin

Abstract

Das Aktinzytoskelett-Protein Myotilin wurde zuerst in Muskelzellen beschrieben. Sein unikaler N-Terminus weist eine serinreiche Region auf. Bei verschiedenen Muskelkrankheiten wurden Myotilinmutationen identifiziert, die alle in dieser Region liegen und hauptsächlich Serin- und Threoninreste betreffen. Daher lag die Vermutung nahe, dass potentielle Phosphorylierungsstellen durch die Mutationen beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Myotilin von den Serin-/Threonin-Proteinkinasen PKA (Proteinkinase A), PKCa (Proteinkinase C a) und MAPK (Mitogenaktivierte Proteinkinase) <i>in vitro</i> phosphoryliert werden kann. Die hier gezeigte Abhängigkeit der Phosphorylierung von der Konzentration von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) sowie deren Inhibierbarkeit durch PKA-Inhibitoren unterstreicht die Involvierung der cAMP-abhängigen PKA bei der Phosphorylierung von Myotilin. In der vorliegenden Arbeit wurden einige der potentiellen Phosphorylierungsstellen durch Punktmutagenesen modifiziert. Die meisten der generierten Mutanten zeigten dabei im Vergleich zum Wildtyp ein reduziertes Phosphorylierungsniveau.<br /> Zudem wurden Genanalysen zur Identifizierung von Myotilinisoformen durchgeführt. Humane exprimierte Sequenzbereiche (ESTs) deuten darauf hin, dass sich im Exon 2 intraexonische Spleißstellen befinden, die es in die Exons 2a, b und c aufteilen. Für murines Myotilin existieren solche ESTs jedoch nicht, was Anzeichen für eine größere Komplexität der humanen Variante sein könnte. Durch PCR-(Polymerase-Ketten-Reaktion)-Experimente konnte im Zuge der vorliegenden Dissertation in humanen cDNA-Bibliotheken des Skelettmuskels eine Isoform nachgewiesen werden, der das Exon 2b fehlt. Zudem wurde gezeigt, dass in adulten jedoch nicht in fötalen Herz-cDNA-Bibliotheken eine Isoform ohne Exon 1 exprimiert wird. Schließlich ließ sich auch das Fehlen von Exon 6 bei einigen Isoformen nachweisen.<br /> Bei Untersuchungen des Expressionsmusters von Myotilin in unterschiedlichen Geweben von Maus und Ratte konnte neben den bereits in anderen Studien nachgewiesenen Isoformen mit den hier getesteten Antikörpern zum ersten Mal auch die Isoform III detektiert werden. Zudem wurde im Gehirn der Maus und der Ratte ein kleineres Protein von etwa 38 kDa nachgewiesen, bei dem es sich wahrscheinlich um die Isoform IV handelt.<br /> Die subzelluläre Lokalisation verschiedener humaner Isoformen wurde durch transiente Transfektion untersucht. Dabei lokalisierten die generierten EGFP-Fusionsproteine der Isoformen a, b, c und d perlenschnurartig entlang der Stressfasern und kolokalisierten mit a-Aktinin in den dense bodies. Bei Myotilin g war dagegen eine Lokalisation im Bereich des kortikalen Aktinzytoskeletts zu erkennen. Dass Myotilin g trotz fehlender Aktinbindungsstelle mit dem kortikalen Aktinzytoskelett assoziiert ist, deutet darauf hin, dass Myotilin auch indirekt über andere Proteine an Aktin binden kann oder dass es eine zweite Aktinbindungsstelle besitzt.<br /> Durch indirekte Immunfluoreszenzstudien konnte Myotilin im Darm in der Ring- und Längsmuskulatur detektiert werden. Überraschenderweise war Myotilin jedoch auch an den Zell-Zell-Grenzen der Epithelzellen der Darmzotten nachweisbar, wo es eine partielle Kolokalisation mit Markern für die Zonula occludens sowie Zonula adherens zeigte. Außerdem war Myotilin zum Teil im apikalen Bereich der Zellen, vermutlich in den Mikrovilli oder im Terminalgeflecht, zu beobachten. In Kardiomyozyten wurde Myotilin in den Z-Scheiben sowie in den Glanzstreifen nachgewiesen.<br /> Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit machen deutlich, dass Myotilin nicht nur zum Aufbau und zur Erhaltung der Z-Scheiben im Muskel dient, sondern - vergleichbar mit anderen aktinbindenden Proteinen wie Filamin oder a-Aktinin - eine versatile Rolle auch in Glattmuskel- und Nichtmuskelzellen spielt. Myotilin könnte demnach Funktionen beim Aufbau von Zell-Zell- und/oder Zell-Matrix-Kontakten übernehmen und zusammen mit anderen Proteinen für deren Verankerung am Aktinzytoskeletts verantwortlich sein.