Transcriptome dynamics and molecular cross-talk between bovine oocyte and its companion cumulus cells

Abstract

The bi-directional communication between the oocyte and its companion cumulus cells (CCs) is crucial for development and functions of both cell types. The objectives of this study were to identify transcripts that are exclusively expressed either in oocyte or CCs and those which are differentially expressed when the oocyte matures with or with out their companion CCs and vice versa and to investigate functional changes associated with transcripts that are significantly changed during CCs in vitro maturation (IVM). In experiment 1A, CCs were physically removed from oocytes at GV stage by repeated in and out pipetting and the resulting denuded oocytes (DOs) and their companion CCs were frozen. In experiment 1B, intact COCs were cultured; CCs were physically removed and the resulting denuded MII oocytes and their CCs were frozen. In experiment 2, CCs were physically removed from oocytes at GV stage and the resulting (OO-CCs) and other pools of intact oocytes (OO+CCs) were cultured and their CCs were physically removed and both oocytes were frozen. In experiment 3, the ooplasm were micro surgically removed at GV stage and the resulting oocytectomized complexes (CCs-OO) and other intact complexes (CCs+OO) were cultured. The ooplasm were removed from CCs+OO and the resulting MII CCs frozen. In experiment 4, CCs were physically removed from their enclosed oocytes both at GV and MII stages and frozen for subsequent total RNA isolation. In both cases, cells were cultured for 22 hrs and each experiment was repeated three times using pools of biological replicates (n=150). 15 μg of fragmented and biotin labelled cRNA was hybridized with Affymetrix GeneChip®Bovine Genome Array and data were analyzed using linear model for microarray. Significantly changed gene ontology (GO) terms, gene networks and canonical pathways were analyzed using GO consortium and Ingenuity pathway analysis (IPA) respectively. In experiment 1A, of 13162 detected probe sets, 1516 and 2727 are exclusively expressed in GV oocytes and CCs respectively, and 8919 are expressed in both. Similarly, in experiment 1B, of 13602 detected probe sets, 1423 and 3100 are exclusively expressed in MII oocytes and CCs respectively, and 9079 are expressed in both. In experiment 2, 265 transcripts are differentially expressed of which 217 and 48 are over expressed in OO+CCs and OO-CCs, respectively. In experiment 3, of 566 differentially expressed transcripts, 320 and 246 are over expressed in CCs+OO and CCs-OO, respectively. In experiment 4, of 12827 detected probe sets, 4689 and 834 are exclusively expressed in GV and MII CCs respectively, while 7304 are expressed in both. Oocyte specific transcripts include those involved in transcription (IRF6, POU5F1, MYF5, MED18), translation (EIF2AK1, EIF4ENIF1), biopolymer metabolic process (MOS, ACVR1, ZNF529, MAP3K3), DNA replication (MCM6, NASP, ORC6L), protein amino acid phosphorylation (MAP4K2, PRKCH, MOS) and CC specific ones include those involved in macromolecule biosynthetic process (APOA1, USPL1, APOE, NANS), carbohydrate metabolism (HYAL1, PFKL, PYGL, MPI), protein metabolic processes (IHH, APOA1, PLOD1), steroid biosynthetic process (APOA1, CYP11A1, HSD3B1, HSD3B7). While transcripts over expressed in OO+CCs are involved in carbohydrate metabolism (ACO1, 2), molecular transport (GAPDH, GFPT1) and nucleic acid metabolism (CBS, NOS2), those over expressed in CCs+OO are involved in cellular growth and proliferation (FOS, GADD45A), cell cycle (HAS2, VEGFA), cellular development (AMD1, AURKA, DPP4) and gene expression (FOSB, TGFB2). Signal transduction, cholesterol biosynthetic processes, DNA replication, cellular growth and proliferation, actin filament polymerisation and cell adhesion are among the top significantly changed biological functions associated with transcripts that are differentially expressed between GV and MII CCs. In conclusion, this study generated large scale gene expression data from different oocyte and CCs samples that would enhance our understanding of the molecular mechanisms underlying oocyte-CCs dialogue in general and oocyte maturation in particular.

<strong>Transkriptomedynamik und molekulare Kommunikation zwischen Rindereizellen und deren umgebenden Kumuluszellen</strong><br /> Die bidirektionale Kommunikation zwischen der Eizelle und den sie umgebenden Kumuluszellen (CCs) ist ausschlaggebend für die Entwicklung und Funktion beider Zelltypen. Die Ziele dieser Studie waren Transkripte zu identifizieren, die ausschließlich in den Eizellen oder den CCs exprimiert werden, sowie Transkripte, die unterschiedlich während der Maturation der Eizellen mit oder ohne der sie umgebenden Kumuluszellen exprimiert werden und umgekehrt. Zum Schluss sollten funktionelle Änderungen untersucht werden, welche mit Trankripten assoziiert sind, die sich signifikant während der in vitro Maturation (IVM) ändern. Im Experiment 1A wurden die CCs physikalisch von den Eizellen im GV Stadium durch wiederholtes Pipettieren entfernt und die freiliegenden Eizellen (DOs) sowie die CCs eingefroren. Im Versuch 1B wurden die intakten Kumulus-Eizellen-Komplexe (COCs) kultiviert, anschließend die CCs physikalisch entfernt und die freiliegenden MII Eizellen und die CCs eingefroren. Im Experiment 2 wurden die CCs wiederum physikalisch während des GV Stadiums entfernt und sowohl die daraus resultierenden Eizellen ohne CCs (OO-CCs) als auch Pools mit intakten Eizellen (OO+CCs) wurden kultiviert. Danach wurden die CCs von den intakten Eizellen entfernt und alle Eizellen eingefroren. Im Experiment 3 wurde das Ooplasma mikro-chirurgisch im GV Stadium entfernt und die Eizellenektomierten Komplexe (CCs-OO) sowie andere intakte Komplexe (CCs+OO) kultiviert. Das Ooplasma wurde im MII Stadium ebenfalls von den CCs+OO entfernt und die MII CCs eingefroren. Im vierten Experiment wurden die CCs sowohl im GV als auch im MII Stadium physikalisch von den Eizellen entfernt und für die nachfolgende totale RNA Isolation eingefroren. In beiden Fällen wurden die Zellen 22h kultiviert und jedes Experiment wurde dreimal wiederholt, indem Pools von biologischen Replikaten (n = 150) verwendet wurden. 15 μg der fragmentierten und Biotin-gelabelten cRNA wurden mit dem Affymetrix GeneChip®Bovine Genome Array hybridisiert und die Daten wurden mittels eines linearen Models für Microarray Daten analysiert. Signifikant veränderte Genontologie (GO), Gennetzwerke und kanonische Pathways wurden mit Hilfe von GO Konsortien beziehungsweise der Ingenuity Pathway Analyse (IPA) untersucht. Im Versuch 1A wurden von 13162 detektierten Proben 1516 ausschließlich in den GV Eizellen und 2727 in den GV CCs exprimiert, wohingegen 8919 Proben sowohl in den Eizellen als auch den CCs exprimiert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden im Experiment 1B erzielt. Hierbei wurden von 13602 detektierten Proben 1423 ausschließlich in MII Eizellen sowie 3100 in MII CCs exprimiert. 9079 Proben wurden in beiden Zelltypen exprimiert. Beim zweiten Versuch wurden 265 Transkripte unterschiedlich exprimiert, wovon 217 in OO+CCs beziehungsweise 48 in OO-CCs überexprimiert wurden. Im Versuch 3 wurden von den 566 Transkripte 320 in CCs+OO beziehungsweise 246 in CCs-OO überexprimiert. Beim vierten Experiment wurden von 12827 detektierten Proben 4689 ausschließlich in CCs des GV Stadiums sowie 834 in den CCs des MII Stadiums exprimiert, wohingegen 7304 in beiden Stadien exprimiert wurden. Eizell-spezifische Transkripte beinhalten Gene, die bei der Transkription (IRF6, POU5F1, MYF5, MED18), der Translation (EIF2AK1, EIF4ENIF1), den biopolymer-metabolischen Prozessen (MOS, ACVR1, ZNF529, MAP3K3), der DNA Replikation (MCM6, NASP, ORC6L) sowie an der Protein-Aminosäuren Phosphorylierung (MAP4K4, PRKCH, MOS) beteiligt sind. Die CCs-spezifischen Transkripte schließen Gene mit ein, die für die makromolekularen, biosynthetischen Prozesse (APOA1, USPL1, APOE; NANS), den Carbohydratmetabolismus (HYAl, PFKL, PYGL, MPI), die Protein-metabolischen Prozesse (IHH, APOA1, PLOD1) und für die Steroid-biosynthetischen Prozesse (APOA1, CYP11A1, HSD3B1, HSD3B7) verantwortlich sind. Während Transkripte, die in den OO+CCs überexprimiert wurden, am Carbohydratmetabolismus (ACO1 und 2), am molekularen Transport (GAPDH, GFPT1) und am Nukleinsäurenmetabolismus (CBS, NOS2) involviert sind, sind Transkripte, die in CCs+OO überexprimiert wurden, für das zelluläre Wachstum und die zelluläre Proliferation (FOS, GADD45A), den Zellzyklus (HAS2, VEGFA), die zelluläre Entwicklung (AMD1, AURKA, DPP4) und die Genexpression (FOSB, TGFB2) verantwortlich. Die Signalübertragung, der Cholesterol-biosynthetische Prozess, die DNA Replikation, das zelluläre Wachstum und die zelluläre Proliferation, die Aktinfilament Polymerisation und die Zelladhäsion gehören zu den, sich am signifikantesten verändernden, biologischen Funktionen, welche mit den Transkripten in Verbindung stehen, die zwischen dem GV und MII Stadium unterschiedlich exprimiert wurden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine große Anzahl an Genexpressionsdaten von unterschiedlichen Eizellen und CCs Proben generiert hat, die unser Verständnis für die molekularen Mechanismen, welche dem Eizellen –Kumuluszellen Dialog im Allgemeinen und Maturation der Eizelle im Speziellen unterliegen, verbessern könnten.