Untersuchungen zur O-GlcNAc-Glykosylierung von Proteinen aus Endothel- und Skelettmuskelzellen

Abstract

Die O-GlcNAcylierung ist eine Ernährungs- und Stress-sensible Proteinmodifikation, welche eine Vielzahl regulatorischer Funktionen in zellulären Prozessen, wie Transkription, Signaltransduktion und Stoffwechsel, ausübt. Hyperglykämie führt zur verstärkten GlcNAcylierung von Proteinen, was zur Entstehung von Glucosetoxizität, endothelialer Dysfunktion und Insulinresistenz beiträgt, drei hauptsächlichen Kennzeichen des Diabetes mellitus Typ 2. <br /> Um die Fragen zu beantworten, welche Proteine Veränderungen in ihrer O-GlcNAc-Modifikation unter hyperglykämischen Bedingungen zeigen, wurden humane Endothelzellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC) und humane skelettale Muskelzellen (SkMC) in Standardglucosemedium (LG, Kontrolle) und „Hoch Glucose“ Medium (HG) in An- und Abwesenheit des O-GlcNAcase-Inhibitors PUGNAc (LGP/HGP) kultiviert. Die O-GlcNAc-modifizierten Proteine wurden in der 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und im Anschluss nach einem Western Blot mit dem O-GlcNAc-spezifischen, monoklonalen Antikörper CTD 110.6 nachgewiesen. Parallel wurden die O-GlcNAc-modifizierten Proteine aus Coomassie gefärbten Gelen ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und mittels MALDI-ToF- bzw. ESI-MS über MASCOT Mascot Peptide Mass Fingerprint bzw. MS/MS Ions Search und der Swiss-Prot Datenbank zugeordnet. <br /> In den HUVEC wurden 24 und in den SkMC 37 O-GlcNAc-modifizierte Proteine identifiziert. Diese Proteine sind Transkriptionsfaktoren, Strukturproteine, Proteine der Energie-/Redoxregulation, metabolische Enzyme und Proteine mit Chaperonfunktion. Bei vielen Proteinen führte die Inkubation mit HG, HGP oder LGP zum Anstieg der O-GlcNAc-Modifikation, wohingegen einige andere Proteine eine Verringerung der O-GlcNAcylierung im Vergleich zur Standardkultivierungen zeigten. Die Stärke der O-GlcNAc-Modifikation einiger Proteine unterschied sich nach HG- oder PUGNAc-Kultivierung, was darauf hinweist, dass die erhöhte Metabolisierung der Glucose durch den Hexosaminbiosyntheseweg und weitere Glucose-abhängige Signalwege andere Effekte hervorruft als die Inhibierung der O-GlcNAcase.

<strong>Analysis of O-GlcNAc-glycosylation of proteins of endothelial and skeletal muscle cells</strong><br /> O-GlcNAcylation is a nutrient/stress-sensitive protein modification with regulatory functions in a wide array of cellular processes, including transcription, signalling, and metabolism. Hyperglycaemia leads to elevated GlcNAcylation of proteins, which contributes to glucose toxicity, endothelial dysfunction and insulin resistance, three major hallmarks of type 2 diabetes. <br /> In order to answer the question which proteins change their level of O-GlcNAc modification under hyperglycaemic conditions, HUVEC and SkMC were treated with normal (LG) and high glucose (HG) media with or without the O-GlcNAcase inhibitor PUGNAc (LGP/HGP). O-GlcNAc modified proteins were investigated by two-dimensional gel electrophoresis and subsequent Western blotting using O-GlcNAc-specific monoclonal antibody CTD 110.6. <br /> 24 O-GlcNAc-modified proteins of HUVEC and 37 O-GlcNAc-modified proteins of SkMC were identified after in-gel Trypsin digest by MALDI-ToF- or ESI-mass spectrometry, MASCOT and Swiss-Prot database search. These proteins are transcription factors, structure proteins, proteins of the energy-/redox regulation, metabolic enzymes and have chaperon function. Many proteins showed an increase of the O-GlcNAc-modification after incubation with HG, HGP or LGP, whereas on some proteins the O-GlcNAc level decreased compared to the standard cultivation. The level of O-GlcNAc-modification of some proteins was different after HG- or PUGNAc-cultivation indicating that the increased flux of glucose through the HBP and further glucose-dependent pathways may have different effects than the inhibition of O-GlcNAcase.