Etablierung und Anwendung von molekular‐zytogenetischen Methoden an reproduktionsgenetischen und klinisch‐genetischen Fragestellungen

Abstract

Diese Arbeit beruht auf fünf Teilprojekten (ein reproduktionsgenetisches und vier klinischgenetische).Im Rahmen des reproduktionsgenetischen Projekts wurde ein Schnell-CGH-Protokoll zur Einzelzell- und Polkörperanalyse entwickelt, indem jeder Schritt des konventionellen CGHProtokolls verändert bzw. verkürzt worden war, so dass die Durchführung von einem Zeitraum von 72 h auf 16 h reduziert werden konnte. Die Technik ermöglicht die simultane Analyse aller Chromosomen in einem Experiment. Das etablierte Protokoll wurde an verschiedenen Fragestellungen validiert und zeigte zuverlässige Ergebnisse, so dass es sich sowohl für eine pränataldiagnostische Anwendung, als auch in der Polkörperdiagnostik eignet. Durch Anwendung des Protokolls an Einzelzellen mit bekannten Trisomien 18 und 21 konnten Gewinne der Chromosomen 18 bzw. 21 detektiert werden. Außerdem wurde das Protokoll an 32 ersten Polkörpern von 16 Patientinnen im Alter von 33 bis 44 Jahren, die hauptsächlich aufgrund von erhöhtem mütterlichen Alter und wiederholtem Implantationsversagen in Behandlung waren, angewandt. Es wurde eine Aneuploidierate von 75 % detektiert, die fast alle Chromosomen betraf (Landwehr et al. 2008). Das erste klinisch-genetische Teilprojekt betraf Patienten mit mentaler Retardierung (MR), die etwa 2-3 % der Bevölkerung ausmachen, wobei die Ursache in 50 % der Fälle ungeklärt bleibt. In dieser Studie wurden mittels genomweiter array-basierter CGH, die das Genom mit einer Auflösung von 0,5 Mb abdeckte, Mikrodeletionen und Mikroduplikationen als Ursache für die MR in 10 % der 60 Fälle mit unklarer Ätiologie identifiziert. Es wurden entweder aufgrund der vollständigen Abdeckung der Region auf den DNA-Chips oder mittels FISH-Analysen exakte Bruchpunkte der Alterationen bestimmt, um deletierte oder duplizierte Gene, die möglicherweise Einfluss auf den MR-Phänotyp haben, zu identifizieren. Bei sechs Patienten konnten Mikroimbalancen detektiert werden, die vermutlich kausativ für deren Phänotyp waren. Fünf Patienten mit MR, fazialen Dysmorphien, neurologischen Auffälligkeiten (drei Fälle), Hirnanomalien (zwei Fälle) und Wachstumsstörungen (zwei Fälle) wiesen Mikrodeletionen in den chromosomalen Banden 6q11.1-q13 (10,8 Mb), Xq21.31-q21.33 (4,0 Mb), 1q24.1-q24.2 (3,8 Mb), 19p13.12 (2,1 Mb) bzw. 4p12-p13 (1,1 Mb) auf. Eine Mikroduplikation wurde in 22q11.2 (2,8 Mb) bei einer Patientin mit milder MR, Mikrozephalie und Dysmorphien detektiert. Drei der Aberrationen entstanden de novo, während zwei ererbt worden waren (Engels, Brockschmidt, Hoischen, Landwehr et al. 2007). Im zweiten klinisch-genetischen Projekt wurde eine Patientin untersucht, bei der klinisch ein Pitt-Hopkins Syndrom (PHS) diagnostiziert worden war. Ihr klinisches Bild (schwere MR ohne Sprachentwicklung, Atmungsanomalien, bestimmte faziale Dysmorphien) stimmte mit zuvor beschriebenen PHS-Patienten überein. Wenn sich die Atmungsanomalien, die ein charakteristisches Merkmal darstellen, spät manifestieren, kann es zu einer Verzögerung der Diagnosestellung kommen. Bei der Patientin wurde mittels Array-CGH und FISH-Analysen eine de novo Mikrodeletion von annähernd 0,5 Mb in Chromosom 18q21.2 detektiert, die lediglich ein bekanntes Gen, den Transkriptionsfaktor TCF4, beinhaltete. Wir konnten mittels RT-PCR-Analyse zeigen, dass die Mikrodeletion unserer Patientin zu einer funktionellen Haploinsuffizienz von TCF4 führt und somit dieses als PHS-Gen bestätigen. Dieses Ergebnis wurde unabhängig voneinander von zwei anderen Gruppen (Zweier et al. 2007; Amiel et al. 2007) beschrieben. Nach der Identifizierung des Gens ist es nun möglich, die klinische Diagnose des PHS mittels genetischer Testung zu bestätigen. Da sowohl größere Umbauten, die das gesamte TCF4-Gen umfassen, als auch Punktmutationen in diesem Gen beschrieben wurden, sollten bei Verdacht auf ein PHS MLPA-Untersuchungen und Sequenzierungen des Gens durchgeführt werden (Brockschmidt, Todt, Ryu, Hoischen, Landwehr et al. 2007). Im dritten klinisch-genetischen Teilprojekt wurde ein Kollektiv von zehn Patienten mit ungeklärten syndromalen Nephropathien, die renale und extrarenale Symptome aufwiesen und keinem bekannten Syndrom zugeordnet werden konnten, untersucht werden. Durch die Untersuchung dieser Patienten mittels array-basierter CGH konnten wir zeigen, dass es sich um eine geeignete Methode handelt, um genetische Ursachen syndromaler Nephropathien zu identifizieren und eine Diagnose zu stellen. Eine Patientin, ein 14-jähriges Mädchen, wies ein contiguous gene Syndrom in Chromosom Xq22.3-q23 auf, das in dieser Form zuvor noch nicht beschrieben worden war. Die 3,3 Mb große, de novo entstandene Mikrodeletion wurde mit FISH und MLPA-Analysen verifiziert und enthielt das X-chromosomale Alport-Syndrom Gen COL4A5, die MR-Gene FACL4 und PAK3 und Teile des DCX-Gens, das mit double cortex-Bildung, MR und Epilepsie assoziiert ist. Der Phänotyp unserer Patientin vereint damit Aspekte des Alport-MR contiguous gene Syndroms mit double cortex und Epilepsie (Hoischen, Landwehr et al. 2009). Im vierten klinisch-genetischen Projekt ermöglichte die array-basierte CGH in einem Kollektiv von 30 Patienten, die sowohl kongenitale Anomalien der Nieren und ableitenden Harnwege (CAKUT) als auch zusätzliche extrarenale Symptome aufwiesen, die Kartierung von vier chromosomalen Regionen, die mit dem CAKUT-Phänotyp assoziiert sind. Bei einem Patienten und seinem Bruder fanden sich ein terminaler Verlust von 0,59 Mb in 1q44 und ein Gewinn von 6,55 Mb in 16q23.3-q24.3. Diese Imbalancen können bei der Entstehung einer Hypospadie eine Rolle spielen. Eine FISH-Analyse zeigte, dass die Aberrationen der Patienten auf eine vorliegende unbalancierte 1;16-Translokation zurückzuführen waren. Der gesunde Vater der beiden Patienten wies eine balancierte 1;16-Translokation auf. Außerdem wurde bei einem Patienten eine 11,93 Mb große Deletion der Region 3q23-25.1 detektiert und es konnte gezeigt werden, dass diese Deletion, die das AGTR1-Gen enthält, mit einer renalen Dysplasie und einer Hydronephrose einhergehen kann, so dass eine Haploinsuffizienz von AGTR1 kausativ für den renalen Phänotyp sein könnte. Da bei einem CAKUT-Patienten eine 2,93 Mb große Mikroduplikation im chromosomalen Band 1q21.1 identifiziert wurde, konnte das Spektrum der Symptome des bereits beschriebenen 1q21.1 Mikroduplikationssyndroms um einen renalen Phänotyp erweitert werden, der bisher in diesem Zusammenhang nicht beschrieben worden war.