Identifikation von Calmodulin und C-Myc als Interaktionspartner von Polyduktin

Abstract

Die autosomal rezessiv vererbte polyzystische Nierenkrankheit ARPKD (autosomal recessive polycystic kidney disease) ist mit einer Inzidenz von 1 in 20.000 Lebendgeburten zu den häufigsten Nephrophatien im Kindesalter. Das klinische Spektrum ist sehr variabel, und in etwa 50% der Fälle versterben die Betroffenen noch innerhalb des ersten Lebensjahrs aufgrund einer respiratorischen Insuffizienz. Die Erkrankung manifestiert sich in Niere und Leber, indem es zur Ausbildung von Zysten in den Sammelrohren der Niere, sowie zu Hyperplasie und Dysplasie der Gallengänge in der Leber kommt. Letztere entstehen durch eine Fehlentwicklung der Duktalplatte, die während der embryonalen Entwicklung der intrahepatischen Gallengänge den Portaltrakt umgibt. Klassischerweise ist die ARPKD mit einer fortschreitenden kongenitalen Fibrose assoziiert, die innerhalb der hepatischen Periportalfelder auftritt.<br /> Bei der ARPKD handelt es sich um eine monogenetische Erkrankung, die durch Mutationen im PKHD1-Gen (polycystic kidney and hepatic disease 1) verursacht wird. Der genomische Lokus umfasst 500kb genomischer DNA, in denen mindesten 86 Exone enthalten sind, die in einem komplexen Muster verschiedener Spleißvarianten zusammen gesetzt werden. Der längste offene Leserahmen beinhaltet 67 Exone, die für das Protein Polyduktin (Fibrosystin) kodieren. Polyduktin besteht aus 4074 Aminosäuren und besitzt laut Struktuvorhersagen eine große extrazelluläre N-terminale Domäne mit zahlreichen funktionellen Motiven, eine singuläre Transmembrandomäne und mit einem kurzen cytoplasmatischen C-Terminus mit potentiellen Phosphorylierungsstellen. Der Aufbau des Proteins weist auf eine Funktion als Rezeptor hin. Darüber hinaus scheint der C-Terminus von Polyduktin abgespalten und in den Zellkern transloziert zu werden. <br /> Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen die gesamte 12,2 kb umfassende murine pkhd1cDNS zu isolieren und in ein eukaryotisches Espressionsplasmid zu ligieren. Durch Sequenzierungen, in vitro-Translation und Wester-Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass der Leserahmen der cDNS nach der PCR-Amplifikation unverändert erhalten blieb. Dies konnte auch durch Zellkulturexperimente bewiesen werden. Nach Transfektion von Cos7-Zellen mit der pkhd1cDNS und einem eGFP-pkhd1-Fusionskonstrukt konnte Polyduktin an der Zellmembran und in vesikulären Strukturen im Zytoplasma nachgewiesen werden. Eine Vitalfärbung der Lysosomen zeigte, dass es sich bei den angefärbten Vesikeln um Lysosomen handelt. Die Lokalisation des rekombinanten Polyduktin in den Lysosomen ist vermutlich auf dessen Transport zu den Lysosmen über Phagozytose und Autophagozytose aufgrund der Überexpression zurückzuführen. Durch die Experimente konnte sichergestellt werden, dass die pkhd1cDNS für weitere Funktionsanalysen und die Suche nach Interaktionspartner genutzt werden kann.<br /> Die Funktion von Polyduktin ist bislang ungeklärt. Die klonierte pkhd1cDNS diente als Grundlage für die Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner mittels der Tandem-Affinitäts-Aufreinigung. Zu diesem Zweck wurde ein Fusionsprotein aus der TAP-Domäne und dem C-Terminus des murinen Polyduktin hergestellt und in HEK293T-Zellen exprimiert. Als potentielle Interaktionspartner wurden ϐ-Tubulin, Aktin und Calmodulin durch Massenspektrometrie identifiziert. Die Interaktion des murinen Polyduktin C-Terminus mit Calmodulin, konnte durch Koimmunopräzipitation und Zellkulturexperimente in Cos7-Zellen bestätigt werden. Die Zelkulturexperimente zeigten, dass es zu einer Kolokalisation des Polyduktin C-Terminus und Calmodulin im Zytoplasma, im Zellkern und den Centrosomen kommt.<br /> Um den Zusammenhang zwischen C-Myc und Polyduktin näher zu analysieren, wurden die beiden bereits beschriebenen Mauslinien Rosa26Δneo myc/myc (Jäger et al., 2004) und Pkhd1ex40 del/del (Moser et al., 2005) miteinander gekreuzt. Die doppelttransgenen Mäuse zeigten keine Veränderung der Niere, allerdings konnte eine signifikant erhöhte Proliferationsrate der Cholangiozyten nachgewiesen werden. Zellkulturexperimente zeigten darüber hinaus, dass es zu einer Kolokalisation des Polyduktin C-Terminus und C-Myc in den Nukleoli des Zellkerns kommt. <br /> Sowohl die Interaktion von des Polyduktin C-Terminus mit Calmodulin an den Centrosomen, als auch die Interaktion mit C-Myc in den Nukleoli, weisen auf eine Rolle von Polyduktin in der Kontrolle des Zellzyklus hin. Es könnte sich bei Polyduktin folglich um ein Tumorsuppressorprotein handeln.<br /> Darüber hinaus könnte Calmodulin nach der proteolytischen Abspaltung des Polyduktin C-Terminus durch eine direkte Interaktion an dessen Translokation in den Zellkern beteiligt sein.