Intrazelluläre Dynamik des Transkriptionsfaktors STAT1

Abstract

In dieser Arbeit wurde die intrazelluläre Dynamik des Transkriptionsfaktors Signal Transducer and Activator of Transcription 1 (STAT1) in humanen Zellen unter physiologischen Bedingungen analysiert. Diese regulatorischen Proteine agieren als direkte Signaltransduktoren von hormonabhängigen Signalketten und können ein Signal direkt vom Rezeptor in der Zellmembran zu den Zielgenen im Nukleus übermitteln. STAT1 befindet sich im unphosphorylierten Zustand präferentiell im Zytoplasma, erst nach einer Stimulation mit extrazellulären Zytokinen, wie z.B. IFNγ, werden die STAT1-Proteine phosphoryliert und bilden aktive Homodimere. In aktivierter Form werden die STAT1-Proteine über einen Transportfaktor-vermittelten Mechanismus in den Nukleus importiert, um dort an spezifische Promotersequenzen zu binden und die Genexpression zu initiieren. Jedoch findet auch in unstimulierten Zellen ein konstitutiver Austausch von unphosphorylierten STAT1 zwischen dem Zytoplasma und dem Nukleus statt. Die STAT1-Proteine sind in verschiedenen essentiellen zellulären Prozessen involviert, wie z.B. in der Immunabwehr, der Wachstumskontrolle, der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung. Durch die Visualisierung einzelner STAT1-Moleküle kann die Mobilität von STAT1 in der Rolle als Signalüberträger und Transkriptionsfaktor in lebenden Zellen beobachtet und charakterisiert werden. <br /> Dazu wurden zuerst die dafür benötigten Mess- und Analysemethoden mit einem inerten Protein entwickelt. Die Mobilitätsanalysen mit dem inerten Protein Ovalbumin wurden herangezogen um die strukturelle Beschaffenheit des Nukleoplasmas und des Nukleolus zu untersuchen. Im Nukleus sind die Kerndomänen nicht wie die zytoplasmatischen Organellen durch Membranen abgegrenzt. Trotzdem ist der Nukleus in funktionell und morphologisch unterschiedliche Kompartimente organisiert. Dabei stellt sich die Frage wodurch sich diese intranukleären Strukturen voneinander abgrenzen. Da Ovalbumin frei in den und aus dem Nukleus diffundieren kann und in humanen Zellen keine Interaktionen eingeht kann man ein unterschiedliches Verhalten von Ovalbumin im Nukleoplasma und im Nukleolus direkt mit einer unterschiedlichen Beschaffenheit der beiden nukleären Kernregionen assoziieren. Fluoreszenzmarkiertes Ovalbumin wurde in HeLa-Zellen injiziert und mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. Ovalbumin verteilte sich gleichmäßig in der gesamten Zelle, nur in den Nukleoli befand sich deutlich weniger Ovalbumin. Die Analyse der Ovalbumindynamiken auf Einzelmolekülebene hingegen wies auf keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Nukleoplasma und dem Nukleolus hin. Die identifizierten Mobilitäten sowie die Anzahl der Moleküle waren in beiden Regionen fast gleich, nur die Bindungsdauer von Ovalbumin in den beiden Regionen war unterschiedlich. Somit wurde die unterschiedliche Verteilung von Ovalbumin im Nukleus von HeLa-Zellen voraussichtlich durch die längeren unspezifischen Interaktionen der Ovalbuminmoleküle im Nukleoplasma und durch weniger frei zugänglichen Raum in den Nukleoli hervorgerufen.<br /> Für die Untersuchung der Dynamik von STAT1 vor und nach Aktivierung wurden zuerst drei verschiedene ATTO647N-fluoreszenzmarkierte STAT1-Varianten in das Zytoplasma von HeLa-Zellen injiziert und am konfokalen Mikroskop beobachtet. Der STAT1-Wildtyp und eine N- und C-terminal verkürzte Deletionsmutante, die inaktive Form von STAT1, verteilten sich in den Zellen annähernd homogen. Im Vergleich dazu zeigten die konfokalen Aufnahmen der intrazellulären Verteilung des phosphorylierten Wildtyps STAT1-P, die aktive Form von STAT1, und der STAT1-wt in IFNγ-stimulierten Zellen eine nukleare Akkumulation. Anschließend wurden die Mobilität und die Interaktionen der STAT1-Proteine am Einzelmolekülmikroskop mit einer Zeitauflösung von circa 5 ms und einer Lokalisierungsgenauigkeit von ungefähr 10 nm beobachtet. Die Aktivierung der STAT1-Proteine in lebenden Zellen führte zu einer drastischen Änderung der Mobilität. Im Nukleus kam es zu einer Immobilisierung und zu einer längeren Bindungsdauer von STAT1-P und von IFNγ-stimulierten STAT1-wt, da die aktiven STAT1-Proteine voraussichtlich and die DNA banden um die Transkription zu aktivieren. Die inaktiven Varianten hingegen wiesen eine heterogene Mobilitätsverteilung auf und waren vorwiegend im Zytoplasma zu sehen.