Methodenentwicklung zur enantioselektiven Trennung von Polyphenolen in unterschiedlichen Matrices

Abstract

<p>Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden zur chiralen Trennung einiger enantiomerer als auch diastereomerer Polyphenole entwickelt und optimiert.<br /> Die Methodenentwicklung beschränkte sich hierbei nicht nur auf Inhaltsstoffe bestimmter Lebensmittel, sondern umfasste zusätzlich Humanplasma als komplexe biologische Matrix. Im Vordergrund der methodischen Entwicklungen stand die chirale Trennung der monomeren Flavan-3-ole (+)- und (–)-Catechin sowie (+)- und (–)-Epicatechin.<br /> Die Wahl der eingesetzten analytischen Geräte war von der zu erwartenden Konzentrationsmenge der Verbindungen in der jeweiligen Matrix abhängig. In Kakao liegen hohe Konzentrationen an Catechinen vor. Orangen und Orangensäfte enthalten größere Mengen an Flavanonglykosiden. Folglich war es bei beiden Fällen erfolgversprechend, die Kapillarelektrophorese mit Diodenarraydetektor (DAD) als analytisches Verfahren einzusetzen.<br /> Da der menschliche Organismus nur Bruchteile der aufgenommenen Flavanole resorbiert, sind im Humanplasma Konzentrationen im Nanogramm pro Milliliter-Bereich zu erwarten. Für einen derart niedrigen Konzentrationsbereich ist das CE-DAD System nicht ausreichend empfindlich. Als Verfahren der Wahl kam somit ein chirales HPLC–System mit coulometrischem Elektrodenarray-Detektor (CEAD) zum Einsatz, da diese Art von Detektion eine sehr hohe Empfindlichkeit aufweist.<br /> Methodenentwicklung zur chiralen CE-Trennung von Flavanonglykosiden:<br /> Vier in Orangensaft vorkommende Flavanonglykoside (Hesperidin, Didymin, Narirutin und Narirutinglykosid) wurden unter Einsatz eines speziellen kapillarelektrophoretischen Verfahrens chiral, teilweise zum ersten Mal in ihre jeweiligen Diastereomere getrennt. Der erste Anhaltspunkt für die Methodenentwicklung war die Arbeit von Gel-Moretó (2003) [59], in welcher bereits die Flavanonglykoside Hesperidin und Narirutin mittels CE chiral analysiert wurden.<br /> Zur Aufkonzentrierung der Verbindungen am Anfang der Kapillare und zur Verbesserung der Trennung wurde das „Sample Stacking“-Verfahren angewendet.<br /> Als chiraler Selektor wurde eine Kombination aus HP-β-CD und CM-β-CD eingesetzt. Durch Variation weiterer kapillarelektrophoretischer Parameter (pH-Wert des Puffers, Pufferzusammensetzung und CD-Konzentration) konnte eine Basislinientrennung aller vier Diastereomerenpaare erreicht werden.<br /> Methodenentwicklung zur chiralen Trennung von Flavan-3-olen mittels CD-MEKC:<br /> Durch Einsatz eines kapillarelektrophoretischen Verfahrens, der CD-MEKC, wurde eine Referenzmethode zu der CZE-Methode von Kofink et al. (2007) [86], entwickelt, die eine chirale Trennung der in Kakao vorkommenden monomeren Flavan-3-ole (Catechin und Epicatechin) ermöglicht. Hierzu wurden unterschiedliche Pufferzusammensetzungen und Pufferkonzentrationen getestet. Als Mizellbildner wurde SDS verwendet und dessen Konzentration optimiert. Der zur chiralen Trennung benötigte und am besten geeignete Selektor ist bei dieser Methode, wie auch bei der CZE, das HP-γ-CD.<br /> Es wurden mit CD-MEKC sowie mit der CZE [85] Kakaoproben analysiert und die erhaltenen Ergebnisse aus beiden Methoden verglichen, wobei sich eine sehr gute Übereinstimmung ergab.<br /> Chirale Trennung der Flavan-3-ole in Humanplasma mittels HPLC-CEAD:<br /> Unter Verwendung einer permethylierten Gamma-Cyclodextrinsäule (PM-γ-CD) wurde eine chirale HPLC Methode zur Trennung der Catechin-Enantiomere entwickelt. Zusammen mit der Erprobung einer geeigneten Aufarbeitungsmethode für Humanplasmaproben ist es gelungen, die monomeren Flavan-3-ole der glucuronidierten und sulfatierten Metabolite chiral in Humanplasma nach Kakaogenuss zu analysieren.<br /> Nach bisherigem Wissensstand ist dies die erste in der Literatur beschriebene chirale Trennung der Catechin-Enantiomeren in menschlichem Blutplasma [143].<br /> Die Methode liefert hohe Wiederfindungen und gute Reproduzierbarkeiten, sowie niedrige Werte für die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen. In einem Selbstversuch konnte schließlich gezeigt werden, dass tatsächlich beide Flavanol-Enantiomere vom menschlichen Organismus resorbiert werden. Anhand weiterer Selbstversuche wurde festgestellt, dass die atypischen Enantiomere offensichtlich einem anderen Metabolismus unterliegen oder möglicherweise nicht in dem gleichen Umfang resorbiert werden, wie die von Natur aus im Kakao vorkommenden Catechine.<br /> Um dies exakt aufklären zu können, ist es erforderlich, die methylierten Catechine ebenfalls chiral analysieren zu können. Erst dann kann eine eindeutige Aussage über die Bioverfügbarkeit der Catechin-Enantiomere gemacht werden. Dies konnte im Laufe dieser Arbeit nicht realisiert werden.</p>

<strong>Method development for enantioselective separation of polyphenols in different matrices </strong><br /> New methods for the chiral separation of polyphenols in different matrices by capillary electrophoresis (CE) as well as by high performance liquid chromatography (HPLC) were developed. The methods are not limited to foodstuffs; they also cover biological matrices. Human plasma after consumption of cocoa was analysed to detect (+)/(–)-catechin and (+)/(–)-epicatechin. For the chiral analysis of the flavan-3-ols in human plasma, a HPLC-CEAD-System (HPLC with coulometric electrode array detector) was used. The CEAD is highly sensitive and is able to detect polyphenols in concentrations of a few ng/mL. Using a permethylated-γ-cyclodextrin HPLC-Column, a chiral HPLC method was developed for the flavan-3-ol enantiomeres catechin and epicatechin. After a suitable sample preparation method for human plasma with enzymatic hydrolysis of the glucuronidated and sulfated metabolites, it was possible to separate the monomeric flavan-3-ols. This method shows high recovery, good reproducibility and low limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ). In a self-experiment, it could be noticed that both enantiomeres of catechin were absorbed from human organism. <br /> Two further methods were developed:<br /> 1. a new method for chiral separation of flavanonglycosides in citrus juice by CE with “sample stacking”. Thereby, it was possible to chirally separate four flavanonglycosides (hesperidin, didymin, narirutin and narirutin-4´-glycoside) in orange juice.<br /> 2. a cyclodextrin modified micellar electrokinetic chromatography method (CD-MEKC) to chirally separate flavan-3-ols in cocoa and cocoa products. The CD-MEKC was compared to an already existing CZE Method [Kofink M. 2009] for chiral separation of (+)/(–)-catechin and (+)/(–)-epicatechin. Both methods provide the same results but the CD-MEKC method shows better resolution.