Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Inhibitors der PH-Domäne der Cytohesin-Familie

Abstract

Die Pleckstrin-homologe Domäne (PH-Domäne), die in vielen Proteinen zu finden ist, ist durch ihre Interaktion mit Phosphoinositiden (z.B. PIP3) entscheidend an der Membranrekrutierung dieser Proteine beteiligt.<br /> Die Regulation der Membranrekrutierung kann die Funktion der zu rekrutierenden Proteine beeinflussen. So können Signalproteine, die an die Membran rekrutiert werden, in der Regel erst dort mit Interaktionspartnern der Signaltransduktion in Wechselwirkung treten und damit ihre Funktion ausfüllen. Dies trifft auch auf die Proteinklasse der Cytohesine zu, die mit ihren verschiedenen direkten und indirekten Interaktionspartnern (IR, IRS, Integrin, Arf) erst nach Rekrutierung an die Membran interagiert.<br /> Bislang konnte auf die Membranrekrutierung der Cytohesine nur indirekt, durch Einsatz des PI3K-Inhibitors Wortmannin, eingegriffen werden. Er inhibiert die Bildung von PIP3, dem Hauptinteraktionspartner der PH-Domäne der Cytohesine. Da über PIP3 jedoch auch verschiedene andere Signalwege vermittelt werden, wird für eine spezifische Regulation der Membranrekrutierung der Cytohesine ein spezifischer PH-Domänen Inhibitor benötigt.<br /> In der vorliegenden Arbeit konnten aus einer Bibliothek von 12.000 Substanzen Inhibitoren der Cytohesin PH-Domäne (Cyplecksins) identifiziert werden. Hierzu wurde ein Aptamerverdrängungsscreening auf Basis der Fluoreszenzintensitätsmessung des Nukleinsäurefarbstoffs RiboGreen entwickelt.<br /> Diese Methode ermöglicht, im Unterschied zu bereits bekannten Aptamerverdrängungsassays (z.B. auf Basis von Fluoreszenzpolarisation oder FRET), den direkten Einsatz eines in vitro transkribierten, ungelabelten RNA-Aptamers. Mit dieser Methode wird zudem das Repertoire an aptamerbasierten Hochdurchsatzscreenings erweitert.<br /> Es konnte gezeigt werden, daß die identifizierten Cyplecksins in der Lage sind, in vitro die Bindung von Cytohesin an PIP3-haltige Membranen zu inhibieren.