Modulierung der Guaninnukleotid Austauschfaktoren Tiam1 und Vav1 durch RNA-Aptamere

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der in vitro Selektion von spezifisch bindenden RNA-Aptameren gegen die Dbl-homologe Domäne der Rho-GEFs Tiam1 und Vav1. Einhergehend mit der spezifischen Bindung sollten die selektierten Aptamere die Guaninnukleotid-Austauschaktivität der beiden Austauschfaktoren blockieren. Im Rahmen eines chemisch biologischen Ansatzes ist abschließend der Frage nachgegangen worden, ob sich selektierte Aptamere als Werkzeuge zur Identifikation von Tiam1/Vav1-spezifischen chemischen Inhibitoren eignen.<br /> Für Tiam1 gelang die Anreicherung von Aptameren mit einer Affinität im mittleren nanomolaren Bereich, dabei zeigte sich das affinste Aptamer K91 als selektiv bindend - die homologe Vav1-DH-Domäne wurde hierbei nicht erkannt. Durch kinetische Untersuchungen des Guaninnukleotid-Austauschs an der GTPase Rac2 ist überdies die Inhibition der GEF-Aktivität von Tiam1 durch die Aptamere K11 und K91 bewiesen worden. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte ein Aptamer-Verdrängungsassay basierend auf luminescence oxygen channeling etabliert werden. Ein Hochdurchsatzscreening mit der Arbeitskreis eigenen Substanzbibliothek führte zur Identifizierung von zwei Grundstrukturen, die den Tiam1-vermittelten Nukleotidaustausch an Rac2 mit einer IC50 kleiner als 100 µM inhibieren. Durch den Vergleich der Hitstrukturen mit chemisch-ähnlichen Verbindungen der Substanzbibliothek konnten erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet werden. Die in vitro Selektion gegen die autoinhibierte sowie konstitutiv aktive DH-Domäne von Vav1 führte zur Anreicherung von Aptamersequenzen mit einer mittleren nanomolaren Affinität. Wiederum durch kinetische Messungen sind alle selektierten und spezifisch-bindenden Aptamere im Vav1-vermittelten Nukleotidaustausch an Rac1 charakterisiert worden. Im Kontrast zu Tiam1 war keine Sequenz in der Lage die GEF-Aktivität von Vav1 zu inhibieren. Jedoch gelang der Nachweis, dass die beiden selektierten Aptamere V21 und V22 die Src-Kinase vermittelte Phosphorylierung des katalytisch wichtigen Tyr174 erhöhen. Da die Phosphorylierung von Tyr174 mit der Aktivierung der DH-Domäne von Vav1 einhergeht, sind die selektierten Aptamere indirekt an einer Modulierung der GEF-Aktivität beteiligt.<br /> Der letzte Teil der Arbeit beschreibt die Entwicklung eines GTPase-Aktivierungssensors, der sich durch einen homogenen, sensitiven und robusten Aufbau auszeichnet. Ebenfalls basierend auf luminescence oxygen channeling erlaubt dieser die Detektion von kleinsten Mengen aktiver Rho-GTPase Rac1 im Zelllysat. Ferner deuten Vorversuche mit anderen kleinen GTPasen daraufhin, dass sich der Sensor universell einsetzen lässt.

The work presents the in vitro selection scheme and characterization of identified RNA aptamers specifically recognizing the DH domain of the Rho GEFs Tiam1 and Vav1. Two aptamers K11 and K91 target Tiam1 with dissociation constants in the mid-nanomolar range and additionally show an inhibitory influence on the in vitro guanine nucleotide exchange reaction on the small GTPase Rac2. Furthermore an aptamer displacement assay based on luminescence oxygen channeling was established and utilized to screen 18000 structurally diverse small molecules. Eventually two core structures were identified that show similar to the parent aptamer an inhibition on the Tiam1-catalyzed guanine nucleotide exchange reaction on Rac2.<br /> For the DH domain of Vav1 four aptamers have been selected. They show specificity for Vav1 and do discriminate between the closely related GEF Tiam1. In contrast, no inhibition on the Vav1-catalyzed guanine nucleotide exchange on Rac1 was observed. Surprisingly two sequences are able to modulate/activate the Src-dependent phosphorylation of the crucial residue Tyr174 within the N-terminal inhibition loop. <br /> In addition a homogenous assay, based on luminescence oxygen channeling that allows monitoring the activation state of small GTPases has been developed.