Das seltene kompatible Solut N-Acetyl-glutaminylglutamin-1-amid (NAGGN)

Abstract

Das Hauptaugenmerk der vorliegenden Arbeit richtete sich auf das kompatible Solut NAGGN, ein bislang relativ wenig untersuchtes Solut, das zu der Gruppe der acetylierten Aminosäurederivate gehört. Das NAGGN-Gencluster ist unter den Bakterien weiter verbreitet als bisher angenommen. Es tritt hauptsächlich in den Familien der Pseudomonadaceae und der Frankinae auf. Der leicht kultivierbare und molekularbiologisch zugängliche Organismus P. putida KT2440 synthetisiert das kompatible Solut NAGGN unter osmotischem Stress. Eine Isolierung des kompatiblen Soluts NAGGN aus diesem Organismus wurde durch die Co-Solute Trehalose und Mannitol erschwert. Deshalb wurde für die Isolierung des kompatiblen Soluts NAGGN ein heterologes Expressionssystem ausgewählt.<br /> Der Stamm E. coli wurde für die Expression und Deletion von einzelnen plasmidkodierten Genen des NAGGN-Genclusters aus P. putida KT2440 zur Aufklärung der NAGGN-Biosynthese verwendet. Durch die Deletion einzelner, plasmidkodierter Biosynthesegene zeigte sich, dass das Gen PP1748, das für eine Peptidase kodiert, nicht für die NAGGN-Synthese notwendig ist oder alternativ durch andere Peptidasen des Expressionswirts E. coli komplementiert werden kann. Eine Überexpression des Gens PP1750 in dem Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) führte zu einer internen Erhöhung des Glutamatspiegels. Die höchste Aktivität des Enzyms PP1749, eine N-Acetyltransferase, konnte in in vitro Assays bei dem Einsatz der Substrate Glutamin bzw. Glutamat festgestellt werden. <br /> Der Expressionswirt E. coli wurde in dieser Arbeit ebenfalls für die heterologe Expression des kompatiblen Soluts NAGGN verwendet. Hier wurde zum einen die Funktionalität des Promotors der Ectoinbiosynthesegene aus H. elongata in E. coli und eine erfolgreiche Expression des NAGGN-Genclusters gezeigt. Die größte NAGGN-Akkumulation konnte mit einem Trehalose defizienten E. coli Stamm (Burdziak, 2006) erzeugt werden. Ein Vergleich aller Expressionsstämme zeigte, dass die höchste Produktivität mit dem konstruierten Stamm H. elongata AKB erzielt werden konnte, weil dieser Stamm auch NAGGN ins Medium entlässt. <br /> Das moderat halophile Gram-negative Bakterium H. elongata wurde zur genomischen Integration des NAGGN-Genclusters aus P. putida KT2440 eingesetzt. Das wirtseigene Gencluster für das kompatible Solut Ectoin wurde derart ausgetauscht, dass das integrierte NAGGN-Gencluster unter der Kontrolle des osmoregulierbaren Ectoinbiosynthese Promotors steht. Die Bedingungen für die Expression mit dem konstruierten Stamme H. elongata AKB wurden optimiert, so dass mit der sich anschließenden Fermentation in einem 15 L Maßstab eine Basis für folgende Aufreinigungsprozesse zur Isolierung des kompatiblen Soluts NAGGN gebildet wurde. Die Aufreinigungsprozesse wurden durch Verwendung eines Vollentsalzers drastisch vereinfacht, zeitlich verkürzt und der Reinheitsgrad des Endprodukts NAGGN wurde zudem gesteigert. <br /> Die Isolierung des kompatiblen Soluts NAGGN eröffnete die Möglichkeit die Substanz zu charakterisieren. Dies geschah in Form von Supplementierungs- und Proteinstabilisierungsversuchen, in denen NAGGN mit weiteren Soluten verglichen wurde. Darüber hinaus wurden die Oberflächeneigenschaften der Solute NAGGN, Ectoin und Hydroxyectoin bioinformatisch analysiert. Für die Untersuchung einer Protein-stabilisierenden Wirkung wurde das Enzym Laktatdehydrogenase (LDH) eingesetzt. Unter Verwendung von Einfrier-Auftau-Zyklen wurde gezeigt, dass das kompatible Solut NAGGN schon in der relativ geringen Konzentration von 50 mM stabilisierende Wirkung auf dieses Enzym zeigte. Eine Analyse der Oberflächeneigenschaften unterschiedlicher kompatibler Solute zeigte, dass Protein-stabilisierende Osmolyte grundsätzlich eher eine negative Oberflächen Polarität aufweisen. Das kompatible Solut NAGGN nimmt unter den analysierten kompatiblen Soluten eine Sonderstellung ein, weil bislang kein anderes Osmolyt nahezu gleiche Anteile positiver und negativer Oberflächenanteile besitzt.