Zelluläre dynamische Massenumverteilung zur Erfassung der Signalwegsaktivierung 7-transmembranärer Rezeptoren unter besonderer Berücksichtigung des M₄-Acetylcholinrezeptors

Abstract

Ein methodisch grundlegender Teil dieser Arbeit bestand darin, die Signalwegsaktivierung Sonden-freier, unterschiedlich gekoppelter 7-transmembranärer Rezeptoren mit dem neuen optischen Biosensor Epic^® (Corning, NY) in Ganzzellmessungen zu untersuchen. Dazu wurde der M₂-Acetylcholinrezeptor, als präferenziell Gα_i/o-gekoppelter Modellrezeptor, sowie der adrenerge β₂-Rezeptor, als klassischer präferenziell Gα_S-gekoppelter Rezeptor, gewählt. Als Vertreter eines Gα_q/11-gekoppelten-Rezeptors wurde der M₃-Acetylcholinrezeptor untersucht. <br /> Durch den Einsatz von selektiven Signalwegs-Inhibitoren bzw. -Aktivatoren (PTX, CTX, YM 254890) wurden alle drei Hauptsignaltransduktionswege in CHO-Zellen identifiziert. Die Rezeptor-vermittelten Signale konnten dabei eindeutig dem von ihnen präferenziell angesprochenen Signalweg zugeordnet werden.<br /> Aufgrund des sich über die Messdauer hinweg verändernden Epic^®-Signals wurde überprüft, ob der Ablesezeitpunkt einen Einfluss auf die Wirksamkeit von Agonisten ausübt. Dabei konnte für je einen präferenziell Gα_i/o-, Gα_S-, sowie Gα_q/11-gekoppelten Rezeptor gezeigt werden, dass die Wirksamkeit der Liganden unabhängig von den gewählten Ablesezeitpunkten und Analysemethoden war. <br /> Eine systematische Aktivierung und Inhibition von Komponenten des G_S-Signaltransduktionsweges in CHO-Zellen zeigte, dass der Epic^®-Biosensor solche Interventionen sehr sensitiv zu detektieren vermag, die eine Steigerung des intrazellulären cAMP-Spiegels bewirken. Nachgeschaltet von cAMP konnte vor allem eine Aktivierung der Proteinkinase A und nur schwach eine Aktivierung von Epac detektiert werden. <br /> Für den muskarinischen M₃-Rezeptor konnte erstmalig eine Kontext-abhängige Rekrutierung von Signalwegen gefunden werden, die sich in einer erst unter erhöhten intrazellulären cAMP-Spiegeln auftretenden Gα_i/o-Kopplung äußerte.<br /> Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte durch [³⁵S]GTPγS-Bindungsuntersuchungen an Membransuspensionen aus hM₄-CHO-Zellen eine dualsterische Rezeptorbindung der muskarinischen Hybridliganden Phth-6-Iper und Naph-6-Iper sowie eine rein orthosterische Bindungstopographie ihrer Muttersubstanz Iperoxo festgestellt werden. Für Iperoxo wurde am M₄-Rezeptor eine gegenüber Acetylcholin deutlich erhöhte Wirksamkeit bei voller intrinsischer Aktivität detektiert, die auch durch Messung zellulärer dynamischer Massenumverteilung bestätigt wurde. Die von Iperoxo abgeleiteten Hybridverbindungen wiesen in diesem Messansatz nur noch einen Partialagonismus und eine Wirksamkeit auf dem Niveau von Acetylcholin auf. In Ganzzell-DMR-Messungen zeigten die Hybridverbindungen ebenfalls eine Wirksamkeit auf dem Acetylcholin-Niveau bei jedoch vollagonistischer intrinsischer Aktivität. <br /> Trotz gleicher Bindungstopographie konnte an hM₄-CHO-Zellen, nicht jedoch an hM₂-CHO-Zellen, eine Hybrid-induzierte Gα_S-Aktivierung gemessen werden. Ein Vergleich der Acetylcholin-induzierten Signalwegsaktivierung untermauerte die Hypothese, dass der M₄-Rezeptor, gegenüber dem M₂-Rezeptor, eine höhere Neigung besitzt, an stimulatorische Gα_S-Proteine zu koppeln. <br /> Durch gezielte Mutagenese der konservierten, aromatischen Aminosäure M₄⁴³⁵Trp (Trp 7.35) zu Alanin konnte gezeigt werden, dass das Epitop im inaktiven M₄-Rezeptor keinen Einfluss auf die Affinität des orthosterischen inversen Agonisten N-Methylscopolamin ausübt. Im aktiven Rezeptor war das Epitop Trp 7.35 jedoch beteiligt an der Wirksamkeit der Vollagonisten Acetylcholin, Oxotremorin M sowie Iperoxo, während die intrinsische Aktivität aufrecht erhalten werden konnte, wie es in vorangegangenen Arbeiten auch für den M₂-Rezeptorsubtyp gezeigt wurde (Dissertationsschrift Kebig, 2010). <br /> Die dualsterischen Testsubstanzen Phth-6-Iper und Naph-6-Iper zeigten ebenfalls eine Reduktion der Wirksamkeit, die jedoch schwächer ausgeprägt war als die der Vollagonisten. Im Gegensatz zum M₂⁴²²Trp→Ala-mutierten Rezeptor konnte ein signifikanter Anstieg der intrinsischen Aktivität im Vergleich zum Wildtyp nur für die Testsubstanz Naph-6-Iper gefunden werden. <br /> Die Wirksamkeit des Partialagonisten Pilocarpin blieb unbeeinflusst von der Mutation M₄⁴³⁵Trp→Ala. Es konnte jedoch, wie am M₂-Rezeptor (Jäger et al., 2007), eine Abnahme der intrinsischen Aktivität beobachtet werden. <br /> Damit scheint der Einfluss des Epitopes Trp 7.35 auf die Wirksamkeit von Vollagonisten und dualsterischen Hybridverbindungen sowie die intrinsische Aktivität von Pilocarpin zwischen dem M₄- und dem M₂-Rezeptor konserviert zu sein.