Eine neue fluoreszenzbasierte Methode zur Detektion von Antikörperdimeren in aus Antikörpermonomeren bestehenden Proben

Abstract

Antikörper haben die Eigenschaft, mit der Zeit zu aggregieren, was zu einem Aktivitätsverlust und einer immunologischen Reaktion beim Patienten führen kann. Steuerbare Faktoren, die eine Aggregatbildung wesentlich beeinflussen, sind z.B. Lagertemperatur, Primärpackmittel und Matrixzusammensetzung. Das Ziel der Stabilitätsprüfung ist eine möglichst frühe Erkennung von Antikörperaggregaten idealerweise im Bereich der Dimerbildung von kleiner 5%. Dies erfordert besonders sensitive und nicht invasive Untersuchungsmethoden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein fluoreszenzmikroskopischer Ansatz verfolgt mit der Aufzeichnung von zeitmarkierten, zeitaufgelösten (TTTR) Daten und Auswertungen mittels Photonenzählhistogramm (PCH), Einzelereigniserkennung sowie über die Erstellung von Autokorrelationskurven (ACC) und Anwendung von Autokorrelationsfunktionen (ACF). Als Probe wurde das IgG ABT-325 verwendet, welches mit Alexa Fluor^® 532 Succinimidylester fluoreszenzmarkiert wurde (Alexa-ABT-325). TTTR-Daten können in Bezug auf unterschiedliche Helligkeiten oder Diffusionsgeschwindigkeiten der beteiligten Partikel ausgewertet werden. Für die Diskriminierung zwischen Monomeren und Dimeren ergaben sich folgende Probleme. Die mittels Fluoreszenz-Korrelations- Spektroskopie (FCS) bestimmten Diffusionskoeffizienten von D_Monomer = 3,20 x 10^-11<em>m</em>²<em>/s</em> für das Monomer und D_Dimer = 2,30 x 10^-11<em>m</em>²<em>/s</em> für das Dimer ermöglichten keine hinreichende Differenzierung im Gemisch, da für diese mindestens der Faktor 1,6 zwischen den Diffusionskoeffizienten notwendig ist. Die Anzahl der Label von Alexa-ABT-325 ist poissonverteilt. <br /> Die theoretischen Berechnung für Alexa-ABT-325 Dimere zeigt, dass sich die Verteilungen der Anzahl von Labeln pro Partikel für Monomere und Dimere überschneiden. Wegen dieser Überschneidung der Verteilungen können auch die PCH und die Einzelereigniserkennung nicht zwischen Alexa-ABT-325 Monomer- und Dimeranteilen in einer Probe unterscheiden.<br /> Daher wurde eine neue Methode für die Auswertung der TTTR-Daten entwickelt. Mit dieser werden TTTR-Daten autokorreliert und mittels einer ACF mit zwei festgesetzten Wendepunkten gefittet. Der erste Wendepunkt stellt die Diffusionszeitkonstante des Alexa-ABT-325 Monomers dar. Der zweite Wendepunkt ging mit 100 logarithmisch verteilten Werten zwischen 0,1s und 1s in die Auswertung ein. Die sich ergebenden Anteile für die zweite Fraktion werden über den zweitenWendepunkten aufgetragen und mit einer einfachen Potenzfunktion gefittet. Der Wert des Faktors der Potenzfunktion (cWert) wird mit einer Kalibrierkurve aus simulierten Daten mit bekannten Dimeranteilen verglichen. Die neue Auswertungsmethode benötigt die bestmöglichen Fluoreszenzfluktuationsdaten, die durch die Verwendung kleiner Konzentrationen, langer Messdauern und einer Laserleistung, die nicht zu Sättigungseffekten bei Alexa Fluor^® 532 führte, erzeugt wurden. Die Überprüfung der neuen Auswertungsmethode erfolgte durch die Vermessung von Proben, in denen definierte Mengen an Antikörperdimeren erzeugt wurden. Abschließend wurden bei 4°C und 50°C gelagerte Alexa-ABT-325 Proben vermessen. Die bei 50°C gelagerten Proben wiesen schon in der Intensitätsspur sichtbare Aggregate auf, die allerdings zu zahlreich und groß waren, um die Proben mit der neuen Auswertungsmethode untersuchen zu können. Für die bei 4°C gelagerten Proben konnte eine signifikante Zunahme des Aggregatanteils nach sieben Tagen gezeigt werden, während er bei den ein, zwei und vier Tage gelagerten Proben annähernd gleich war.