A_2B-Adenosin-Rezeptor-Homo- und Heterodimere

Abstract

Die Adenosin-Rezeptoren, welche zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) gehören, werden in die vier Subtypen, A₁, A_2A, A_2B und A₃ unterteilt. Aufgrund der ubiquitären Expression der Adenosin-Rezeptoren und deren vielfältigen physiologischen Funktionen im menschlichen Körper, sind sie als <strong>Targets für die pharmazeutische Wirkstoffentwicklung</strong> besonders interessant. Der A_2A- und der A_2B-Rezeptor sind aufgrund der Homologie in der Aminosäuresequenz nahe verwandte Rezeptoren, die sich jedoch in der Affinität zum endogenen Agonisten Adenosin stark unterscheiden. Während von dem für Adenosin "hoch affinen" A_2A-Rezeptor bereits die Röntgenkristallstruktur publiziert wurde, ist der "niedrig affine" A_2B-Rezeptor der bisher am wenigsten erforschte Adenosinrezeptor-Subtyp. Weder die <strong>Ligand-Bindungsstelle</strong> ist genau bekannt, noch gibt es Informationen darüber, ob der Rezeptor als <strong>Monomer, Dimer </strong>oder<strong> Oligomer</strong> existiert. Basierend auf einem detaillierten Wissen über die Ligand-Bindungsstelle und die Interaktionen von Liganden mit dem Rezeptor könnten <strong>neue, spezifische und hoch potente </strong>Liganden für den Adenosin- A_2B-Rezeptor gezielt entwickelt werden. Diese A_2B-Rezeptor-Liganden könnten möglicherweise zur Behandlung von <strong>inflammatorischen Erkrankungen</strong>, <strong>Asthma, Diabetes und Kreb</strong>s eingesetzt werden. Im Falle einer Existenz von Dimeren könnten z.B. <strong>bivalente Liganden</strong> synthetisiert werden, die spezifisch an Dimere binden und somit ein geringeres Potential an unerwünschten Arzneimittelwirkungen mit sich bringen. Allerdings besitzen solche Verbindungen eine hohe Molmasse, was ihre Bioverfügbarkeit einschränkt. Eine andere Möglichkeit wäre die Hemmung der Dimerisierung durch Inhibition der Protein-Interaktion. Des Weiteren ist es denkbar und sogar wahrscheinlich, dass A_2B-Homomere eine andere Pharmakologie besitzen als z.B. A_2A- A_2B-Heteromere, und diese Unterschiede ließen sich möglicherweise in der Arzneistoffentwicklung nutzen, um spezifischere Wirkungen zu erzielen und Nebenwirkungen zu reduzieren.<br /> Im ersten Teil der Arbeit wurde die Rolle der<strong> zweiten extrazellulären </strong>Schleife (EL2) des <strong>Adenosin- A_2B-Rezeptors</strong> genauer erforscht. Diese könnte, wie bei einigen anderen GPCRs, an der Liganden-Bindung beteiligt sein. Der EL2 des A_2B-Rezeptors wurde mittels 'Overlap-Extension'-Methode durch den EL2 des A_2A-Rezeptors ersetzt. Die daraus resultierende A_2B(EL2-A_2A)-Rezeptormutante wurde stabil in CHO-Zellen exprimiert und sowohl in <strong>Radioligand-Bindungsstudien</strong> als auch in <strong>funktionellen cAMP-Akkumulationsexperimenten</strong> untersucht. Die Ergebnisse der an der A_2B(EL2-A_2A)-Rezeptormutante untersuchten Agonisten (Adenosin, NECA, BAY60-6583, CGS-21680) zeigt im Vergleich zum Wildtypen <strong>stark angestiegene Maximaleffekte (Efficacy)</strong>. Außerdem bindet der <strong>selektive A_2A-Agonist CGS-21680 an die A_2B(EL2-A_2A)-Rezeptormutante und aktiviert</strong> diese, während der A_2B-Rezeptor-Wildtyp nicht mit CGS-21680 interagiert. Alle Ergebnisse zusammengefasst zeigen die wichtige Rolle der zweiten extrazellulären Schleife bei der<strong> Liganderkennung/Ligandbindung</strong> und zusätzlich einen <strong>starken Einfluss auf die Aktivierung</strong> des Rezeptors. Höchstwahrscheinlich fördert oder stabilisiert der EL2 die <strong>Konformation des Rezeptors</strong>, bei der das G_s-Protein an den Rezeptor bindet. Außerdem scheint der EL2 auch an der <strong>Affinitätsdifferenz</strong> von Adenosin-Derivaten zwischen dem A_2A- und dem A_2B-Rezeptor beteiligt zu sein. In Zukunft wäre es von Interesse, zusätzlich – komplementär - die A_2A(EL2- A_2B)-Rezeptormutante zu generieren und zu untersuchen. Interessant wäre hierbei insbesondere das Verhalten des selektiven A_2A-Agonisten CGS-21680 und des A_2B-Agonisten BAY60-6583. Hierbei können weitere Informationen zur Rolle des EL2 gewonnen werden. <br /> Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der <strong>Homodimerisierung von Adenosin- A_2B-Rezeptoren</strong> mittels<strong> Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer</strong> (BRET). Die Ergebnisse aus den BRET-Studien sowie <strong>Verdrängungsexperimenten</strong> belegen die Existenz von A_2B-Homodimeren. Darüber hinaus scheinen sich, betrachtet man die Signalhöhe, auch <strong>Trimere</strong> und/oder <strong>höhere Oligomere</strong> zu bilden. Die Affinität der A_2B-Rezeptoren zueinander ist um den Faktor 10 höher als die des D₂-A_2A-Heterodimers (Positivkontrolle). Die A_2B-Homodimere bilden <strong>sehr stabile Dimere</strong>, welche weder durch Zugabe von <strong>Agonisten</strong> noch durch <strong>Antagonisten</strong> zu Monomeren zerfallen. Es wird vermutet, dass die Dimere bereits im Endoplasmatischen Retikulum gebildet und dann zur Membran transportiert werden, und sich nicht Ligand-induziert in der Membran bilden. Alles deutet auf eine<strong> starke und große Interaktionsfläche</strong> zwischen den Rezeptoren hin. In einer früheren Arbeit wurde beim A_2A-Rezeptor die Aminosäure <strong>Methionin 193</strong> als wichtig für die Protein-Protein-Interaktion postuliert. Die homologe Aminosäure im A_2B-Rezeptor, Methionin 198, zeigt jedoch lediglich einen geringen Einfluss auf die Bindungsstärke zwischen den A_2B-Homodimeren, jedoch beeinflusst es höhere Oligomerisierungformen negativ, wie durch Untersuchung der Met198Ala-Mutante mittels BRET gezeigt werden konnte. Somit führt Met198 möglicherweise zu weniger Tri- bzw. Tetrameren, zugunsten von mehr Dimeren, die aber dafür eine geringfügig höhere Affinität zwischen den Proteinen aufzuweisen scheinen. Das erstellte <strong>Computermodell</strong> schlägt <strong>TM2 und TM6 oder TM7 und TM1</strong> des A_2B-Homodimers <strong>als Interaktionsfläche</strong> zwischen den Rezeptoren vor. Zukünftig sollte die Interaktionsfläche durch Mutagenesestudien genauer eingegrenzt werden. Entsprechende Mutanten könnten mit BRET, FRET sowie der Röntgenkristallstrukturanalyse untersucht werden. Die Frage, welches Verhältnis von A_2B-Monomeren zu A_2B-Homodimeren innerhalb der Zelle vorliegt wäre ein interessanter Forschungsgegenstand, um zu erkennen welche Form den Grundzustand darstellt. Die Signalwege müssten genau untersucht werden, da Monomere und Dimere häufig <strong>unterschiedliche Signalkaskaden</strong> durch verschiedene G-Proteine in der Zelle beeinflussen. Von großem Interesse ist die Frage, ob der A_2B-Rezeptor auch mit anderen Rezeptoren Dimere bilden kann. <br /> Dies wurde im dritten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht, in dem die Existenz von <strong>A_2A- A_2B-Heterodimeren</strong> nachgewiesen werden konnte. Sowohl <strong>BRET-Experimente</strong> als auch <strong>Verdrängungsexperimente</strong> belegen deutlich die Existenz von Adenosin-A_2A- A_2B-Heterodimeren. Aufgrund der Höhe des Signals erscheinen höhere Oligomere eher unwahrscheinlich. Die Affinität des A_2A-Rezeptors zum A_2B-Rezeptor erscheint zwar doppelt so hoch zu sein wie beim A_2A-D2-Heterodimer, aber um den Faktor 5 geringer als beim A_2B-Homodimer. Auch das A_2A- A_2B-Heterodimer ist <strong>sehr stabil </strong>und ließ sich durch keinen der getesteten <strong>Liganden</strong> beeinflussen. Mit Hilfe der <strong>Konfokalen Mikroskopie</strong> konnten die Rezeptoren in der <strong>Zellmembran lokalisiert</strong> werden. Nach den Voraussagen des Computermodells soll die <strong>Interaktionsfläche</strong> des A_2A- A_2B-Heterodimers am wahrscheinlichsten durch die <strong>TM4</strong> des A_2B-Rezeptors und die TM5 des A_2A-Rezeptors gebildet werden. Zukünftig könnten, neben den oben erwähnten Forschungsansätzen, die Gewebe bzw. Zelltypen (Lunge, Blutgefässe, Herz, Gehirn) in denen sowohl der A_2A- als auch der A_2B-Rezeptor gemeinsam exprimiert sind, auf Heteromere hin untersucht werden, um deren <strong>biologische Relevanz</strong> zu klären. Möglicherweise beeinflusst ein Rezeptor den anderen positiv oder negativ in Bezug auf die Ligandbindung und/oder die Funktionalität. <br /> Der vierte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der <strong>Oligomeriserung der Adenosin-Rezeptore</strong>n in Oozyten mit Hilfe der <strong>SDS</strong>- und der <strong>Blauen Nativen-PAGE-Methode</strong>. Das Ergebnis zeigt, dass<strong> A_2A- A_2B-Rezeptoren</strong> nur Dimere und <strong>keine höheren Oligomere</strong> bilden. Für den Nachweis von A_2B-Homooligomeren reichte die Expression der Rezeptoren in den Oozyten nicht aus. Zukünftig könnte versucht werden, entweder die Expression der A_2B-Rezeptoren durch Zugabe geeigneter Substanzen zu erhöhen, oder es könnte eine andere, höher exprimierende Zelllinie für die A_2B-Rezeptor-Expression genutzt werden. Bei den Oligomeren sollte weiter untersucht werden, wie viele G-Proteine an den Rezeptorkomplex assoziiert sind, und welche Signalwege nachfolgend aktiviert werden.