Assessment of virulence factors of a reservoir-borne SARS-related coronavirus by reverse genetics

Abstract

The pandemic of the „Severe acute respiratory syndrome“ (SARS) at the end of 2002 caused more than 8000 infections and led to more than 800 deaths. The disease was soon associated with a new zoonotic coronavirus, the SARS-CoV. At first, civet cats were thought to be the natural reservoir of SARS-CoV, but further studies revealed that SARS-related CoVs are present at high diversities in Asian bats of the genus Rhinolophus. Emerging viruses are a constant threat to public health and it is of utmost importance to evaluate risk factors that facilitate host transitions. <br /> SARS-CoV encodes several accessory proteins with partially known functions in immune evasion. Minor relevance was assigned to those proteins in cell culture models, but it is generally assumed that they might have important functions in the natural reservoir. <br /> Using the full-length genome sequence of a Bulgarian SARS-related bat-CoV (BG-CoV) identified by us in Rhinolophus blasii functionalities of two selected accessory proteins were investigated.<br /> To this end, a Rhinolophus bat embryonic lung cell line carrying the human SARS-CoV receptor angiotensin converting enzyme 2 (hACE2) was established (RhiLu-hACE2) to resemble the SARS-CoV reservoir. Type I interferon assays were established for cells from different hosts and extensive reverse genetic studies on SARS-CoV were conducted to project the zoonotic risk of the bat-borne SARS-related CoV.<br /> (i) Protein 6, encoded by open reading frame 6 (ORF6), interacts directly with Karyopherin (KPN) α2 thereby inhibiting interferon (IFN) signaling. BG-CoV protein 6 (BG-p6) shares 78.1% amino acid similarity with human SARS-CoV protein 6 (SA-p6). Overexpressed BG-p6 was able to inhibit nuclear translocation of co-transfected KPN α2 like SA-p6. Moreover, the IFN antagonistic ability of both proteins was determined by the inhibition of nuclear translocation of overexpressed STAT1 due to the effect described above. It was shown that overexpressed BG-p6 inhibited STAT1 translocation as efficiently as SA-p6.<br /> With the help of the SARS-CoV reverse genetics system a chimeric recombinant SARS-CoV carrying the BG-CoV ORF6 (BGO6-rSCV) was generated for studies in a in the context of viral replication in primate and RhiLu-hACE2 cells. In primate as well as in RhiLu-hACE2 cells BGO6-rSCV replicated less efficiently than wild type rSCV. Interestingly, when cells were preincubated with universal type I IFN BGO6-rSCV exhibited an increased IFN sensitivity on RhiLu-hACE2 cells only. This suggests a host-independent attenuating effect of BG-p6. (ii) The genomic region around ORF8 was subject to an unusual high mutation rate throughout the SARS pandemic. SARS-related CoVs found in Asian Rhinolophus bats, civet cats and early human isolates of SARS-CoV carried a single full-length ORF8. The human pandemic SARS-CoV acquired a 29 nucleotide deletion leading to the disruption of ORF8 into two ORFs, ORF8a and 8b. In the Bulgarian SARS-related bat-CoV we found that ORF8 was entirely missing. Analysis of more Rhinolophid bats from Spain, Italy and Slovenia revealed that most likely all European SARS-related bat-CoVs lack ORF8.<br /> The influence of ORF8 integrity on virus replication was investigated with the help of rSCVs carrying these three ORF8 variants. On primate and bat cell culture rSCV carrying the full-length ORF8 grew to the highest titers, while the ORF8 deletion variant grew the worst. IFN pretreatment of the tested cell lines resulted in an overall decrease in virus replication of all ORF8 variants suggesting an IFN-independent mechanism for ORF8 influenced virus replication.<br /> In summary, the present study showed that BG-p6 was able to antagonize type I IFN signaling in primate cells with wild type efficiency. In the full virus context a SARS-CoV expressing BG-p6 was attenuated in primate and bat cell culture. Furthermore, the absence of ORF8 greatly reduced virus replication efficiency. Taken together both findings suggest potentially reduced virulence of the European SARS-related bat-CoVs. For the first time these data indicate a feasible approach to assessing zoonotic risks emanating from bat-borne SARS-related CoVs.

<strong>Beurteilung von Virulenzfaktoren eines reservoirgebundenen SARS-verwandten Coronavirus mittels reverser Genetik</strong><br /> Die Pandemie des „Schweren akuten respiratorischen Syndroms“ (SARS), die Ende 2002 begann, führte weltweit zu über 8000 Infizierten von denen über 800 starben. Die Krankheit wurde schnell mit einem neuartigen, zoonotischen Coronavirus, dem SARS-CoV, assoziiert. Zunächst standen Schleichkatzen unter Verdacht das natürliche Reservoir des SARS-CoV zu sein. In weiteren Studien konnte jedoch gezeigt werden, dass SARS-ähnliche Coronaviren in hoher Diversität in asiatischen Fledermäusen der Gattung Rhinolophus zu finden waren. Neu auftretende zoonotische Viren stellen eine konstante Gefährdung für die öffentliche Gesundheit dar. Die Beurteilung von Risikofaktoren, die einen Wirtswechsel ermöglichen, ist von größter Bedeutung. <br /> Das SARS-CoV kodiert für eine für Coronaviren ungewöhnlich hohe Anzahl an akzessorischen Genen. Diesen Genen wird meist eine geringe funktionelle Relevanz in Zellkulturmodellen zugesprochen, aber es wird allgemein angenommen, dass sie wichtige Funktionen im natürlichen Reservoir besitzen. <br /> Mit Hilfe der Vollgenomsequenz eines bulgarischen SARS-ähnlichen Fledermaus-CoV (BG-CoV), welches durch unsere Arbeitsgruppe in Rhinolophus blasii gefunden wurde, wurde die Funktionalität zweier ausgewählter akzessorischer Proteine untersucht.<br /> Zu diesem Zweck wurde eine embryonale Lungenzelllinie aus Rhinolophus hergestellt, die den humanen SARS-CoV-Rezeptor Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (hACE2) dauerhaft exprimiert, RhiLu-hACE2. Diese Zelllinie sollte dazu dienen, das Reservoir von SARS-CoV im Zellkulturmodell darzustellen. Es wurden Typ-I-Interferonassays für Zellen verschiedener Herkunft etabliert und umfangreiche revers-genetische Studien am SARS-CoV durchgeführt, um das zoonotische Risiko des SARS-ähnlichen Fledermaus-CoV zu beurteilen. (i) Protein 6, kodiert durch den offenen Leserahmen 6 (ORF6), interagiert direkt mit Karyopherin (KPN) α2 und inhibiert so den Interferon(IFN)-Signalweg. Das BG-CoV Protein 6 (BG-p6) besitzt eine Aminosäureähnlichkeit von 78.1% im Vergleich zum humanen SARS-CoV Protein 6 (SA-p6). Überexprimiertes BG-p6 war wie SA-p6 in der Lage, die nukleäre Translokation von kotransfiziertem KPN α2 zu inhibieren. Die IFN-antagonistische Fähigkeit beider Proteine wurde mit Hilfe der Inhibition der nukleären Translokation von überexprimiertem STAT1, basierend auf den beschriebenen Wechselwirkungen, bestimmt. Überexprimiertes BG-p6 inhibierte die Translokation so effektiv wie SA-p6.<br /> Mit Hilfe des SARS-CoV reversen Genetiksystems wurde rekombinantes SARS-CoV hergestellt, dass das BG-CoV ORF6 trägt (BGO6-rSCV), um Studien im Vollviruskontext in Primaten- und RhiLu-hACE2-Zellen durchzuführen. Sowohl in Primaten- als auch in RhiLu-hACE2-Zellen replizierte das BGO6-rSCV weniger effizient als das Wildtyp-rSCV. Wurden die Zellen mit universellem Typ-I-IFN präinkubiert, zeigte BGO6-rSCV nur auf RhiLu-hACE2-Zellen einer erhöhte IFN-Sensitivität. Das weißt auf einen wirtsunabhängigen attenuierenden Effekt durch BG-p6 hin.<br /> (ii) Die Genomregion um ORF8 unterlag während der SARS-Pandemie einer ungewöhnlich hohen Mutationsrate. SARS-ähnliche CoVs aus asiatischen Rhinolophiden, sowie SARS-CoV-Isolate aus Larvenrollern und Patienten in der frühen Phase der Pandemie trugen ein einzelnes, vollständiges ORF8. Das humane, pandemische SARS-CoV erwarb eine Deletion von 29 Nukleotiden, die das ORF8 in ORF8a und 8b zweiteilte. Im Genom des bulgarischen SARS-ähnlichen Fledermaus-CoVs fehlte ORF8 vollständig. Untersuchungen von weiteren Rhinolophiden aus Spanien, Italien und Slowenien ergab, dass ORF8 sehr wahrscheinlich in alle europäischen SARS-ähnlichen Fledermaus-CoVs fehlt. <br /> Zur Untersuchung des Einflusses der Vollständigkeit von ORF8 auf die Virusreplikation wurden rSCVs konstruiert, die die jeweiligen ORF8-Varianten tragen. In Primaten- und RhiLu-hACE2-Zellen wuchs das rSCV mit dem vollständigen ORF8 am besten. Die ORF8-Deletionsvariante replizierte hingegen am schlechtesten. Eine Behandlung der Zellen mit IFN führte zu einer allgemein verringerten Replikationsrate der Viren, was auf einen IFN-unabhängigen Mechanismus der ORF8-beeinflussten Virusreplikation hindeutet. Die vorliegende Studie legt nahe, dass das BG-p6 mit Wildtyp-Effizienz den Typ-I-IFN-Signalweg in Primatenzellen antagonisiert. Im Vollviruskontext war das SARS-CoV, was BG-p6 exprimiert, in Primaten- und RhiLu-hACE2-Zellen attenuiert. Zusätzlich trug das Fehlen von ORF8 zu verminderter Virusreplikation bei. Zusammenfassend deuten diese Erkenntnisse darauf hin, dass europäische SARS-ähnliche Fledermaus-CoV vermutlich eine verminderte Virulenz besitzen. Außerdem präsentieren die Daten einen zulässigen Ansatz zur Beurteilung des zoonotischen Risikos durch Fledermaus übertragene SARS-ähnliche CoVs.