Molecular Analysis of Genes Involved in the Biosynthesis and Regulation of Hormaomycin, an Exceptionally Complex Bacterial Signaling Metabolite

Abstract

Hormaomycin (HRM) is a nonribosomal peptide antibiotic isolated from <em>Streptomyces griseoflavus</em> W-384. It contains several unprecedented nonproteinogenic building blocks bearing chlorine, nitro or cyclopropyl moieties (Andres et al., 1989). HRM acts as a bacterial hormone by inducing cellular morphogenesis and increasing production titers of antibiotics in other <em>Streptomyces</em> spp.. Additionally, HRM is an antibiotic with high potency against coryneform actinomycetes (Andres et al., 1990) and also exhibits<em> in vitro</em> activity against a range of malarial parasites, such as <em>Plasmodium falciparum </em>(Otoguro et al., 2003).<br /> Studies of HRM biosynthesis have been hampered by genetically inefficient manipulation of its producing strain<em> S. griseoflavus</em> W-384. In addition, the inconsistent and low production of HRM in wild type strain has prevented us from investigation of its antibacterial and hormonal mechanism of action. <br /> In order to address these problems, <em>S. griseosflavus</em> W-384 was firstly optimized for genetic engineering. The protoplast transformation system was established, allowing us to introduce two types of foreign plasmids (integrative and free-replicating) into this strain. Additionally, a conjugation system to mediate plasmid transfer between <em>Escherichia coli</em> and <em>S. griseosflavus</em> W-384 was optimized. The results provided the practical procedures to perform further molecular analysis of HRM biosynthetic genes.<br /> To enhance the fermentation titres of HRM, the role of its cluster-encoded regulatory genes was investigated. A copy of <em>hrmA </em>or<em> hrmB</em> was placed under control of the constitutive <em>ermE*</em> promoter on the pWHM4*-based vector and was individually expressed in S. griseosflavus W-384, resulting in an increase of HRM production and its analogues as much as 135-fold. For the HrmB overproducer, six novel bioactive HRM analogues were isolated and characterized. This study demonstrates that HrmA and HrmB are positive regulators in HRM biosynthesis. A third regulatory gene, <em>hrmH</em>, was identified as a protein capable of shifting the metabolic profile of HRM and its derivatives. Its manipulation resulted in the generation of an additional HRM analogue.<br /> To elucidate the HRM biosynthetic pathway, functional analysis of genes involved in the biosynthesis of unusual amino acids was carried out by gene knock-outs as well as genetic and chemical complementations. The results suggested that <em>hrmI </em>and <em>hrmJ </em>are essential for the biosynthesis of 3-(<em>trans</em>-2’-nitrocyclopropyl)alanine [(3-Ncp)Ala]. Manipulation of <em>hrmD</em> revealed its indispensable role in the biosynthesis of 4-propenylproline [(4-Pe)Pro]. Additionally, an eighth HRM analogue (HRM A₈) was generated by feeding 4-ethinylproline [(4-Et)Pro] into hrmD mutant. HRM A₈ will be further employed to determine molecular target of antibacterial and hormonal activities by “Click chemistry”. The gene knock-out and genetic complementation of hrmQ further proved that <em>HrmQ</em> is a halogenase catalyzing the chlorination of 5-chloro-1-hydroxypyrrole-2-carboxylic acid [Chpca].<br /> HRM, as a signaling metabolite, can induce the aerial mycelia formation and sporulation in other <em>Streptomyces</em> spp.. To investigate its hormonal mode of action, HRM was tested against seven <em>bld</em> mutants derived from well-known <em>Streptomyces coelicolor</em> A3(2) and three bald mutants generated from <em>Streptomyces griseus</em>. <br /> By overexpression of pathway-specific activators and mutasynthesis, eight HRM analogues were discovered and generated. Antibiotic assays with the eighth new congeners provided insights into structure-activity relationship and identified structural positions that could permit the generation of active analogs suitable for pull-down studies and target identification. Molecular analysis of the biosynthetic genes gave deeper insights into the HRM biosynthesis.

<strong>Molekulare Analyse von biosynthetischen und Regulatorgenen des Hormaomycins, eines außergewöhnlich komplexen bakteriellen Signalmetaboliten</strong><br /> Hormaomycin (HRM) ist ein nichtribosomales Peptidantibiotikum, das aus <i>Streptomyces griseoflavus</i> W-384 isoliert wurde. Es enthält mehrere neuartige nicht-proteinogene Bausteine, die Chlor- Nitro- oder Cyclopropylreste beinhalten (Andres et al., 1989). HRM entfaltet eine hormonelle Wirkung auf Bakterien, indem es zelluläre Morphogenese induziert und die Produktionstiter von Antibiotika in anderen <i>Streptomyces</i>-Arten erhöht. Zusätzlich ist HRM ein hoch potentes Antibiotikum gegen corynefome Actinomyceten (Andres et al., 1990) und besitzt außerdem <i>in vitro</i>-Aktivität gegen eine Reihe von Malaria-Parasiten, wie <i>Plasmodium falciparum</i> (Otoguro et al., 2003).<br /> Studien zur Biosynthese von HRM waren wegen ineffizienter genetischer Manipulation des Produktionsstammes <i>S. griseoflavus</i> W-384 erschwert. Außerdem war aufgrund der unbeständigen und niedrigen Produktion von HRM die Untersuchung des antibakteriellen und hormonellen Wirkmechanismus nicht möglich.<br /> Um diese Probleme zu adressieren, wurde <i>S. griseoflavus</i> W-384 zunächst für genetische Manipulation optimiert. Es wurde ein Protoplasten-Transformationssystem etabliert, das es erlaubte, zwei Arten von fremden Plasmiden (integrative und frei replizierende) in den Stamm zu integrieren. Zusätzlich wurde ein Konjugationssystem optimiert, das den Transfer von Plasmiden zwischen <i>Escherichia coli</i> und <i>S. griseoflavus</i> W-384 vermitteln sollte. Die Ergebnisse bildeten die experimentelle Basis für die weitere molekulare Analyse der Biosynthesegene von HRM.<br /> Um die Fermentationstiter von HRM zu erhöhen, wurde die Rolle der im Gencluster codierten Regulatorgene untersucht. Eine Kopie von <i>hrmA</i> oder <i>hrmB</i> wurde unter die Kontrolle des konstitutiven <i>ermE*</i>-Promotor auf dem pWHM4*-basierten Vektor gebracht und individuell in <i>S. griseoflavus</i> W-384 exprimiert, was in einer bis zu 135-fachen Erhöhung der Produktion von HRM und Analoga resultierte. Aus dem HrmB-Überproduzenten wurden sechs neue, bioaktive HRM-Analoga isoliert und charakterisiert. Diese Studie zeigt somit, dass HrmA und HrmB positive Regulatoren in der Biosynthese von HRM sind. Das Produkt eines dritten Regulatorgens, <i>hrmH</i>, wurde als ein Protein identifiziert, das das metabolische Profil von HRM und seinen Derivaten verändern kann. Die Manipulation von <i>hrmH</i> resultierte in der Produktion von einem weiteren HRM-Analog.<br /> Um den Biosyntheseweg von HRM aufzuklären, wurden funktionelle Analysen von Genen, die an der Biosynthese der ungewöhnlichen Aminosäuren beteiligt sind, durch individuelle Ausschaltungen und sowohl genetische als auch chemische Komplementierung durchgeführt. Die Ergebnisse suggerieren, dass <i>hrmI</i> und <i>hrmJ</i> essentiell für die Biosynthese von 3-(<i>trans</i>-2’-Nitrocyclopropyl)alanin [(3-Ncp)Ala] sind. Die Manipulation von <i>hrmD</i> offenbarte die Beteiligung in der Biosynthese von 4-Propenylprolin [(4-Pe)Pro]. Zusätzlich wurde ein achtes HRM-Analog (HRM A₈) durch die Fütterung von 4-Ethinylprolin zur <i>hrmD</i>-Mutante generiert. HRM A₈ kann zukünftig für die Aufklärung des molekularen Targets der antibakteriellen und hormonellen Aktivität durch „Klick-Chemie“ eingesetzt werden. Die Ausschaltung und genetische Komplementierung von <i>hrmQ</i> bewiesen weitergehend, dass HrmQ eine Halogenase ist, die die Chlorierung von 5-Chloro-1-hydroxypyrrol-2-carbonsäure [Chpca] katalysiert.<br /> HRM als Signalmetabolit kann die Ausbildung von Luftmycel und Sporulation in anderen Streptomyces-Arten induzieren. Um den hormonellen Wirkmechanismus zu untersuchen, wurde HRM gegen sieben <i>bld</i>-Mutanten von <i>Streptomyces coelicolor A3(2)</i> und drei <i>bld</i>-Mutanten von <i>Streptomyces griseus</i> getestet.<br /> Insgesamt wurden durch Überexpression von Biosynthese-spezifischen Regulatoren und Mutasynthese acht verschiedene HRM-Analoga entdeckt und generiert. Antibiotische Tests mit den neuen Derivaten gaben Einblicke in Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und konnten Positionen herausstellen, die die Generierung von aktiven Analoga für „Pull-down“-Studien und die Identifizierung des molekularen Targets ermöglichen. Die molekulare Analyse von Biosynthesegenen ergab weitere Einblicke in die Biosynthese des Hormaomycins.