Exosomal and non-exosomal circulatory miRNAs in bovine follicular fluid

Abstract

Growth and development of bovine follicle and oocyte is the result of series of complex and coordinated processes that involves extensive cell-to-cell communication in the follicle. This phenomenon involves enormous complex and heterogeneous biochemical substances existing in the oocytes and its surrounding cells and the follicular fluid. Cell-cell communication within the follicle involves many signaling molecules, and this process may be mediated by secretion and uptake of exosomes that contain several bioactive molecules including extra-cellular miRNAs. The molecular mechanism of oocytes development and interaction between oocyte and follicular cells in the follicular micro-environment remains vague. Follicular fluid and cells from individual follicles of cattle were grouped based on Brilliant Cresyl Blue Pro staining of the corresponding oocytes. Both Exoquick^TM precipitation and differential ultracentrifugation were used to separate the exosome and non-exosomal portion of follicular fluid. Following miRNA isolation from both fractions, the human miRCURY LNA^TM Universal RT miRNA PCR array system was used to profile miRNA expression. Western blot analysis against specific protein and electron microscopy imaging confirms the efficient separation of exosomal and non-exosomal fraction of follicular fluid. The real time qPCR array analysis revealed that a handful number of miRNAs are present in both exosomal and non-exosomal portion of bovine follicular fluid. Results revealed 25 miRNAs differentially expressed (16 up and 9 down) in exosomes and 30 miRNAs differentially expressed (21 up and 9 down) in non-exosomal portion of follicular fluid in comparison of BCB- versus BCB+ oocyte groups. Expression of selected miRNAs was detected in theca, granulosa and cumulus cells that may indicate the origin of extra-cellular miRNAs in follicular fluid. To further explore the potential roles of these extra-cellular miRNAs in follicular fluid, the potential targets were predicted using in silico based analysis, and functional annotation and pathway analysis revealed most of these pathways are known regulators of follicular development and oocyte growth. In order to validate exosome mediated cell-cell communication within follicular microenvironment, we demonstrated uptake of exosomes and resulting increase of endogenous miRNA level and subsequent alteration of mRNA levels in follicular cells <em>in vitro</em>. The present study demonstrates for the first time, the presence of exosome or non-exosome mediated transfer of miRNA in the bovine follicular fluid, and oocyte growth dependent variation in extra-cellular miRNA signatures in the follicular environment.

<strong>Exosomale und non-exosomale zirkulierende miRNAs in der Follikelflüssigkeit beim Rind: Die Rolle von exosomalen miRNAs in der Oozytenentwicklung</strong><br /> Wachstum und Entwicklung der Rinder Follikel und Eizellen ist das Ergebnis einer Reihe von komplexen und koordinierten Prozessen, die umfangreiche Zell-Zell-Kommunikation innerhalb der Follikel beinhaltet. Diese Interaktion beruht auf komplexen und heterogenen biochemischen Stoffen sowohl in den Eizellen, den benachbarten Zellen als auch in der Follikelflüssigkeit. Die Zell-Zell-Kommunikation innerhalb der Follikel ist geprägt durch viele Signalmoleküle. Dieser Prozess kann durch Sekretion und Aufnahme von Exosomen die mehrere bioaktive Moleküle einschließlich extrazellulärer miRNAs enthalten, vermittelt werden. Bisher jedoch, sind die molekularen Mechanismen der Eizellenentwicklung und der Interaktion zwischen Eizellen und Follikelzellen in der follikulären Umgebung noch nicht voll aufgeklärt. Follikelflüssigkeit und Zellen aus einzelnen Rinder Follikeln wurden auf der Grundlage einer Vitalfärbung der entsprechenden Eizellen mittels Brillant Cresyl blau Pro gruppiert. Sowohl eine Exoquick-Präzipitation als auch differentielle Ultrazentrifugation wurde verwendet, um die exosomalen und non-exosomalen Bestandteile der Follikelflüssigkeit zu trennen. Nach miRNA Isolation von beiden Fraktionen wurde mittels des humanen miRCURY LNA^TMUniversal RT miRNA PCR-Array-System, ein miRNA Expressionsprofil erstellt. Durch Western-Blot-Analysen und Elektronen-Mikroskopie konnte die effiziente Trennung von exosomalen und non-exosomalen Bestandteilen in der Follikelflüssigkeit bestätigt werden. Mittels Echtzeit-qPCR-Array-Analysen konnte einige miRNAs im exosomalen und non-exosomalen Teil der Rinder Follikelflüssigkeit nachgewiesen werden. Von diesen waren 25 miRNAs im exosomalen Teil differentiell exprimiert (16 rauf- und 9 runter reguliert) und 30 miRNAs waren im non-exosomalen Teil der Follikelflüssigkeit differentiell exprimiert (21 rauf- und 9 runter reguliert) im Vergleich zu den BCB- versus BCB+ Oozyten Gruppen. Im Anschluss daran, wurde die Expression ausgewählter miRNAs in Thecazellen, Granulosa- und Kumuluszellen ermittelt. Das Ergebnis könnte ein Hinweis auf die Herkunft der extrazellulären miRNAs in der Follikelflüssigkeit sein. Für eine genauere Erklärung der möglichen Funktion dieser extrazellulären miRNAs in der Follikelflüssigkeit wurden potenziellen Zielgene mit in silico Analyse, funktioneller Annotation und Pathway-Analysen untersucht. Dies ergab, dass die miRNAs überwiegend an Signalwegen der Regulation der follikulären Entwicklung und des Eizellen Wachstums beteiligt sind. Um die Ergebnisse in Bezug auf die exosomal vermittelte Zell-Zell-Kommunikation in der follikulären Mikroumgebung zu überprüfen, konnten wir nachweisen, dass aus der Aufnahme des Exosoms in die Zelle eine Erhöhung des miRNA-Levels mit nachträglicher Veränderung des mRNA-Niveaus von Targetgenen in Follikel-Zellen <em>in vitro</em> resultiert. Die vorliegende Studie zeigt zum ersten Mal, den von exosomalen oder non-exosomalen Bestandteilen vermittelten Transfer von miRNA in die bovine Follikelflüssigkeit. Weiterhin ist das Wachstum der Eizellen von den Variationen der extrazellulären miRNA Signaturen in der follikulären Umgebung abhängig.