Investigation of miRNAs enrichment and degradation in bovine granulosa cells during follicular development

Abstract

The granulosa cells in the mammalian ovarian follicle respond to gonadotropin signalling and are involved in the processes of folliculogenesis and oocyte maturation. Although, several studies have been done on spatio temporal expression of genes during follicular development, little is known about the post-transcriptional regulation of those genes. This study unravelled the basic knowledge on bovine miRNA prevalence and expression pattern during the early luteal phase of the bovine estrous cycle. For this, miRNAs enriched total RNA isolated from granulosa cells of subordinate follicles (SF) and dominant follicles (DF) obtained from heifers slaughtered at day 3 and day 7 of the estrous cycle and were subjected for miRNAs deep sequencing. The data analysis revealed that 291 and 318 mature miRNAs were detected in granulosa cells of SF and DF, respectively at day 3 of estrous cycle, while 314 and 316 were detected in granulosa cells of SF and DF, respectively, at day 7 of estrous cycle. A total of 244 detected miRNAs were common to all follicle groups, of which 15 miRNAs including bta-miR-10b, bta-miR-26a, let-7 families, bta-miR-92a, bta-miR-191, bta-miR-125a, bta-miR-148 and bta-miR-30a-5p, were highly abundant (≥3000 reads) in both SF and DF at both days of the estrous cycle. At day 3 of the estrous cycle, 16 miRNAs including bta-miR-449a, bta-miR-449c, bta-miR-212, bta-miR-21-3p, bta-miR-183 and bta-mir-34c were differentially expressed (DE) in granulosa cell of subordinate follicle groups. Similarly, at day 7 of the estrous cycle, a total of 108 miRNAs including bta-mir-409a, bta-miR-2446, and bta-mir-383 were altered in granulosa cells of SF compared to DF. Nine miRNAs including bta-miR-21-3p, bta-miR-708, and bta-miR-335 were commonly DE between SF and DF at day 3 and day 7 of the estrous cycle. In addition to known miRNAs, a total of 21 novel miRNAs were identified and detected in granulosa cells of SF and/or DF at day 3 and day 7 of the estrous cycle. The majority of the DE miRNAs were found to be involved in regulation of programmed cell death and regulation of cell proliferation. In addition, the DE miRNAs were found to be involved in Wnt signaling, TGF-beta signaling, oocyte meiosis, MAPK signaling, focal adhesion, axon guidance and gap junction. Therefore, our findings suggest that temporal variation in the abundance of mature miRNAs during bovine follicular development in SF and DF of granulosa cells, which may be associated with recruitment, selection and development of bovine follicles.

<strong>Untersuchung der miRNA Anreicherung und Abbau in bovine Granulosazellen während der Follikelreifung</strong><br /> Die Granulosazellen aus ovarialen Säugertierfollikeln reagieren auf Gonadotropin-Signale und sind an den Prozessen der Follikulogenese und Eizellenreifung beteiligt. Obwohl bereits mehrere Studien über die spatio-temporale Genexpression während der follikulären Entwicklung erfolgten, ist bisher wenig über die post-transkriptionelle Regulierung dieser Gene bekannt. Daher befasst sich diese Studie mit der Untersuchung von der bovine miRNA Prävalenz und ihrer Expressionsmuster während der frühen Lutealphase des bovinen Östruszyklus. Dafür wurde miRNA angereicherte Gesamt-RNA aus Granulosazellen von untergeordneten Follikeln (SF) und dominanten Follikeln (DF) am Tag 3 und Tag 7 des Östruszyklus von geschlachteten Färsen isoliert und mittels Deep Sequenzierung analysiert. Durch die Datenanalyse konnten jeweils 291 und 317 miRNAs in Granulosazellen von SF und DF am Tag 3 des Östruszyklus ermittelt werden. Für Tag 7 des Östruszyklus gewonnene Granulosazellen konnten 314 und 316 miRNAs identifizierten werden. In allen Follikelgruppen wurden insgesamt 244 miRNAs detektiert, wobei 15 miRNAs einschließlich bta-miR-10b, bta-miR-26a, let-7 families, bta-miR-92a, bta-miR-191, bta-miR-125a, bta-miR-148 und bta-miR-30a-5p in beiden SF und DF und auch an beiden Tagen des Östruszyklus hoch reguliert (≥3000 reads) waren. Am Tag 3 des Östruszyklus waren 16 miRNAs einschließlich bta-miR-449a, bta-miR-449c, bta-miR-212, bta-miR-21-3p, bta-miR-183 und bta-mir-34c unterschiedlich in Granulosazellen der untergeordneten Follikelgruppe exprimiert (DE). Genauso zeigten am Tag 7 des Östruszyklus insgesamt 108 miRNAs einschließlich bta-mir-409a, bta-miR-2446, und bta-mir-383 in SF Granulosazellen im Vergleich zu DF eine unterschiedliche Expression. Neun miRNAs, u.a. bta-miR-21-3p, bta-miR-708 und bta-miR-335 waren sowohl am Tag 3 als auch am Tag 7 DE zwischen SF und DF des Östruszyklus. Insgesamt wurden 21 neue miRNAs zusätzlich zu den bekannten miRNAs in den Granulosazellen von SF und/oder DF am Tag 3 und 7 des Östruszyklus identifiziert und detektiert. Die Mehrheit der DE miRNAs sind an der Regulierung des programmierten Zelltods und der Regulierung der Zellproliferation beteiligt. Gleichwohl waren diese DE miRNAs auch an den Signalwegen Wnt, TGF-beta, Meiose der Eizelle, MAPK, fokal Adhäsion, Axon Guidance und Gap Junction involviert. Deshalb lassen unsere Ergebnisse darauf schließen, dass temporale Variationen in der Anreicherung von miRNAs während der bovinen Follikelentwicklung in SF und DF aus Granulosazellen, welche mit der Rekrutierung, Selektion und Entwicklung boviner Follikel assoziiert werden, vorkommen können.