Generation, enrichment and characterization of bioactive oligosaccharides and peptides from milk

Abstract

Milk is considered to be a rich and one of the most important sources of bioactive compounds containing various milk-borne biologically active constituents or precursor substances for bioactive components. The present work was focused on the production of functional food ingredients of the carbohydrate and protein fraction of milk. The aim of the thesis was the development of procedures for the generation, enrichment and characterization of bioactive oligosaccharides and peptides from milk. Enrichment of bioactive milk-derived oligosaccharides (MOS) was performed by nanofiltration (NF). For generation and identification of anti-inflammatory peptides from bovine β-casein, enzyme preparations with different tryptic and chymotryptic activities were applied. Characterization of the biological activities of the MOS concentrates and the β-casein hydrolysates was performed by the evaluation of the activity of the transcription factor NFκB in human embryonic kidney cells (HEK^nfκb-RE cells) <em>in vitro</em>.<br /><em>Manuscript 1</em>: For the enrichment of MOS (6’-sialyllactose, 3’-sialyllactose, N-acetylgalactosaminyl lactose) by membrane filtration initially a screening and a comparison of the efficiency of different NF membranes was performed on laboratory scale. Successful retention of MOS of 49 % to 84 % in retentate was achieved by application of membranes with a nominal molecular weight cut-off (NMWCO) of 150-400 Da. The transfer of the NF process from laboratory to pilot plant and industrial scale resulted in a comparable retention of MOS in retentate. A 100-fold increase of the MOS content in relation to total sugar content in retentate (10.6 %) compared to the initial sample (0.1 %) was realized after NF on industrial scale using the membrane DOW. This NF retentate was composed of 2.6 % MOS, 28.3 % mono- and disaccharides, 23.5 % citric acid and 24.7 % ash in dry mass. The MOS retentates and the standards (3’-sialyl-lactose, 6’-sialyl-lactose) exhibited increased NFκB activity in HEK^nfκb-REcells. A screening for the efficiency of different NF membranes for the enrichment of MOS on different scales of production was conducted for the first time.<br /><em>Manuscript 2</em>: The NF process for the enrichment of MOS was optimized realizing a better permeation of milk salts and residual sugars during NF at pH 5 and pH 7. As initial sample, the already concentrated NF retentate with a 100-fold increase of MOS content in relation to total sugar content was applied. A high retention of MOS of 68 % to 79 % was realized after NF and diafiltration at acidic and neutral milieu. The high MOS content in relation to total sugar content of 87.3 % to 92.7 % in the retentate at pH 5 and 7 (9-fold higher than in the first NF retentate, 900-fold higher than in the initial sample) indicated a nearly complete permeation of mono- and disaccharides. A higher enrichment of MOS in dry mass (5-fold higher than in the first NF retentate, 140-fold higher than in the initial sample) and an increased permeation of salts were achieved by NF at pH 5. The MOS concentrate at pH 5 was composed of 14.1 % MOS, 1.2 % mono- and disaccharides, 13.3 % citric acid and 21.8 % ash in dry mass. Furthermore, first investigations for the transfer of the procedure to caprine milk resulted in an increased MOS content in relation to total sugar content in retentate (23- to 31-fold higher than in the initial sample) of NF at neutral milieu. For the first time, the influence of the pH on the degree of enrichment of MOS by NF was evaluated.<br /><em>Manuscript 3</em>: Potential anti-inflammatory peptides were generated by hydrolysis of β-casein with the tryptic enzyme preparations Cod Trypsin, porcine Trypsin (tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated) and the tryptic and chymotryptic preparation PTN 6.0 S. The β-casein hydrolysates exhibited a reduced NFκB activity measured as luciferase activity in human embryonic kidney cells (HEK^nfκb-RE cells). β-casein hydrolysates produced by application of enzyme preparations with mainly chymotryptic activity (Cryotin, Cryotin F) did not reveal any effect. The higher the chymotryptic activity present, the lower the anti-inflammatory activity in HEK^nfκb-RE cells. Hydrolysis of β-casein with Cod Trypsin and porcine Trypsin (TPCK) resulted in comparable peptides. Thus, the enzyme preparation Cod Trypsin can replace the non-food grade porcine enzyme preparation Trypsin (TPCK) for the generation of potential anti-inflammatory β-casein derived peptides.

Milch zählt zu den wichtigsten Quellen für bioaktive Substanzen und enthält zahlreiche milchoriginäre bioaktive Komponenten sowie Precursor für bioaktive Komponenten. Der Focus der Arbeit lag auf der Produktion von funktionellen Lebensmittelinhaltsstoffen aus der Kohlenhydrat- und Proteinfraktion von Milch. Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Verfahren zur Generierung, Anreicherung und Charakterisierung von bioaktiven Oligosacchariden und Peptiden aus Milch. Die Anreicherung von milchoriginären Oligosacchariden (MOS) erfolgte mit Hilfe der Nanofiltration (NF). Für die Generierung und Identifizierung von anti-inflammatorischen Peptiden aus bovinem β-Casein wurden Enzympräparate mit unterschiedlichen tryptischen und chymotryptischen Aktivitäten angewendet. Eine Charakterisierung der biologischen Aktivität der MOS Konzentrate und der β-Casein Hydrolysate erfolgte durch die Bestimmung der Aktivität des Transkriptionsfaktors NFκB in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK^nfκb-RE–Zellen) <em>in vitro</em>.<br /><em>Manuskript 1</em>: Für die Anreicherung der MOS (3‘-Sialyllactose, 6‘-Sialyllactose, N-Acetylgalactosaminyl-Lactose) mit Hilfe der Membranfiltration wurde zu Beginn ein Screening und ein Vergleich der Effizienz unterschiedlicher NF-Membranen im Labormaßstab durchgeführt. Eine erfolgreiche Wiederfindung der MOS im Retentat von 49 % bis 84 % wurde bei Einsatz von Membranen mit einem NMWCO (nominal molecular weight cut-off) von 150-400 Da erzielt. Eine Übertragung des NF-Prozesses vom Labor in den Technikum- und Industriemaßstab erzielte eine vergleichbar hohe Wiederfindung der MOS im Retentat. Die NF im Industriemaßstab bei Einsatz der Membran DOW erzielte einen 100-fachen Anstieg des MOS Gehaltes bezogen auf den Gesamtzuckergehalt im Retentat (10.6 %) im Vergleich zur Ausgangsprobe (0.1 %). Das NF-Retentat setzte sich aus 2,6 % MOS, 28,3 % Mono- und Disacchariden, 23,5 % Zitronensäure und 24,7 % Asche in der Trockenmasse zusammen. Die MOS Konzentrate und die Standards (3‘-Sialyllactose, 6‘-Sialyllactose) zeigten eine erhöhte NFκB Aktivität in HEK^nfκb-RE–Zellen. Ein Screening bezüglich der Effizient verschiedener NF-Membranen für die Anreicherung der MOS in unterschiedlichen Produktionsmaßstäben erfolgte zum ersten Mal.<br /><em>Manuskript 2</em>: Der NF-Prozess für die Anreicherung der MOS wurde optimiert. Eine höhere Permeation der Milchsalze und restlichen Zucker während der NF bei pH 5 und 7 wurde erzielt. Als Ausgangsprobe wurde das zuvor konzentrierte NF-Retentat mit einem 100-fach erhöhten MOS Gehalt bezogen auf den Gesamtzuckergehalt verwendet. Eine hohe Wiederfindung der MOS von 68 % bis 79 % wurde nach NF und Diafiltration bei saurem und neutralem Milieu erzielt. Der hohe MOS Gehalt bezogen auf den Gesamtzuckergehalt von 87,3 % bis 92,7 % im Retentat bei pH 5 und pH 7 (9-fach höher als im ersten NF-Retentat, 900-fach höher als in der Ausgangsprobe) zeigte eine nahezu komplette Permeation der Mono- und Disaccharide. Eine höhere Anreicherung der MOS in der Trockenmasse (5-fach höher als im ersten NF-Retentat, 140-fach höher als in der Ausgangsprobe) und eine höhere Permeation der Salze wurden mit der NF bei pH 5 erzielt. Das MOS Konzentrat bei pH 5 setzte sich aus 14,1 % MOS, 1,2 % Mono- und Disacchariden, 13,3 % Zitronensäure und 21,8 % Asche in Trockenmasse zusammen. Des Weiteren führten erste Studien zur Übertragung des Prozesses auf Ziegenmilch zu einem erhöhten MOS Gehalt bezogen auf den Gesamtzuckergehalt im Retentat (23- bis 31-fach höher als in der Ausgangsprobe) der NF bei neutralem Milieu. Der Einfluss des pH-Wertes auf den Grad der Anreicherung der MOS mit Hilfe der NF wurde zum ersten Mal untersucht.<br /><em>Manuskript 3</em>: Potentiell anti-inflammatorische Peptide wurden durch die Hydrolyse von β-Casein mit den tryptischen Enzympräparaten Cod Trypsin, Schweinetrypsin (Tosyl-Phenylalanyl-Chlormethyl-Keton (TPCK)-behandelt) und dem tryptischen und chymotryptischen Präparat PTN 6.0 S generiert. Die β-Casein Hydrolysate zeigten eine reduzierte NFκB Aktivität gemessen als Luciferase Aktivität in HEK^nfκb-RE–Zellen. β-Casein Hydrolysate generiert durch den Einsatz von Enzympräparaten mit hauptsächlich chymotryptischer Aktivität (Cryotin, Cryotin F) zeigten keinen Effekt. Je höher die chymotryptische Aktivität desto geringer war der anti-inflammatorische Effekt in HEK^nfκb-RE–Zellen. Die Hydrolyse von β-Casein mit Cod Trypsin und Schweinetrypsin (TPCK) führten zu vergleichbaren Peptiden. Folglich kann das Enzympräparat Cod Trypsin das „non-food grade“ Präparat Trypsin (TPCK) für die Generierung von potentiell anti-inflammatorischen Peptiden aus β-Casein ersetzen.