Fusogene und endozytotische Liposomen

Abstract

Liposomen sind zum Einschleusen von hydrophilen und hydrophoben Molekülen weit verbreitet. Über welchen Mechanismus die Liposomen in Zellen aufgenommen werden, ist entscheidend für die Wirksamkeit der transportierten Inhalte. In dieser Arbeit wurden die verschiedenen Aufnahmemechanismen von fusogenen Liposomen mit endozytotisch aufgenommenen Liposomen verglichen, um ihren Einfluss auf die Wirksamkeit der eingebrachten Moleküle zu untersuchen. Zunächst wird eine Methode vorgestellt, die anhand der besonderen Fluoreszenzeigenschaften von BODIPY FL die Unterscheidung zwischen Fusion und Endozytose ermöglichte. BODIPY FL bildete bei hohen lokalen Konzentrationen Dimere, welche im Fluoreszenzsignal zu einem zweiten Emissionsmaximum im roten Spektralbereich führten. Während bei einer niedrigen lokalen Konzentration nur das Monomer-Signal im grünen Spektralbereich detektierbar war. Bei endozytotischer Aufnahme von Liposomen blieb ihre Lipidzusammensetzung weitgehend unverändert. Das Dimer-Signal war daher auch innerhalb der Zellen nachweisbar. Bei der Fusion der Liposomen mit der Plasmamembran wurden die liposomale Bestandteile erheblich verdünnt. Die damit einhergehende, für die Fusion charakteristische Verringerung des Dimer-Signals wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie detektiert. Anhand der Analyse des Dimer- und Monomer-Signals wurde eine belastbare Methode etabliert, um Endozytose von Fusion zu unterscheiden.<br /> Im zweiten Teil dieser Dissertation wurden zwei chemotherapeutische Wirkstoffe, Doxorubicin (DXR) und Aclacinomycin A (ACL), mittels fusogener Liposomen in Zellen der der humanen Brustkrebszelllinie MDAMB-231 und der epithelialen Zelllinie MCF-10A eingeschleust. ACL ist DXR strukturell recht ähnlich, ist aber deutlich besser in Lipiden löslich. Die Wirksamkeit der chemotherapeutischen Wirkstoffe war abhängig von der intrazellulär akkumulierten Dosis. Durch ihre unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften ließen sich ACL und DXR verschieden effizient in Liposomen verkapseln. In dieser Arbeit wurde die zelluläre Aufnahme von in Puffer gelöstem ACL und DXR mit der Abgabe durch fusogene Liposomen und durch Polyethylenglycol-modifizierte endozytotische Liposomen als etabliertes System verglichen. Die subzelluläre Verteilung wurde durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchung beider Zelltypen erfasst und die Wirksamkeit der beiden Anthracycline mittels durchflusszytometrischer Methoden bestimmt. Unabhängig vom behandelten Zelltyp war die Wirksamkeit von in endozytotischen Liposomen appliziertem DXR, im Vergleich zu frei in Puffer gelöstem DXR, deutlich verringert. Durch fusogene Liposomen konnte die höchste Wirksamkeit von DXR erzielt werden. Beide Liposomentypen bewirkten im Vergleich zu frei gelöstem Wirkstoff eine deutliche Steigerung der Aufnahmeeffizienz des lipophileren ACL. Für beide Zelltypen waren fusogene Liposomen waren fusogene Liposomen das wirksamste Transportsystem für ACL. Sowohl DXR als auch ACL ließen sich erfolgreich in endozytotische und fusogene Liposomen verkapseln. Fusogene Liposomen waren von den verglichenen Formulierungen die wirksamste Methode, um die beiden Daunorubicin-Derivate in Zellen einzuschleusen. Insgesamt gelang es in dieser Arbeit fusogene Liposomen weiter zu entwickeln und als neuartige Transportmethode für pharmazeutische Wirkstoffe vorzustellen.