Ein zellbasierter Biolumineszenzassay zur Untersuchung der Dimerisierung und Aggregation des Prionproteins

Abstract

Prionenerkrankungen wie z. B. die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit bei Menschen oder die Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE) bei Rindern gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen. Grundlage aller Prionen-Krankheiten ist das zelluläre Prion-Protein (PrP^C) und die infektiöse Isoform PrP^Sc, die im Gegensatz zu PrP^C vermehrt β-Faltblattstrukturen und Aggregate formt. Es gibt Hinweise darauf, dass PrP^C Dimere bilden kann und diese eine Grundlage für die Entstehung von PrP^Sc-Aggregaten sein könnten. Um die Dimerisierung von PrP zu untersuchen, wurden zwei Fusionsprodukte aus PrP mit der N- bzw. C-terminalen Hälfte von Gaussia Luziferase kloniert, die an der Oberfläche von RK13 Zellen exprimiert wurden. Dimerisierte PrP^C an der Oberfläche von transfizierten RK13 Zellen, komplementierten sich beide Luziferasehälften und wurden biolumineszent. Die Dimerisierung von PrP^C konnte mit Antikörpern, die gegen die zentrale Region von PrP^C gerichtet waren blockiert werden. Dies zeigte, dass die zentrale Region für die Dimerisierung von PrP^C eine wichtige Rolle spielte. Eine Infektion der RK13-Zellen mit Hirnhomogenat erkrankter Mäuse, die sechs verschiedene mausadaptierte Prionstämme beinhalteten, führte zu einem Anstieg des Biolumineszenzsignals, während Hirnhomogenat gesunder Tiere keine Auswirkungen auf das Biolumineszenzsignal hatte. Die Behandlung mit dem Antiprion-Wirkstoff Quinacrine führte nur bei den infizierten Zellen zu einer Reduktion des Biolumineszenzsignals.<br /> Darüberhinaus wurde die Biolumineszenzuntersuchung dazu genutzt, Wirkstoffe zu identifizieren, die gegen Prionen wirksam sein könnten. Dazu wurde eine Sammlung von 1650 Wirkstoffen verwendet. Wirkstoffe, die ohne toxisch zu sein, die Dimerisierung von PrP^C inhibierten, wurden an prioninfizierten N2a-Zellen auf ihre Wirksamkeit untersucht, diese Zellen von PrP^Sc zu bereinigen. Dabei wurde der Wirkstoff JTC-801 identifiziert, der bereits in nanomolaren Konzentrationen die PrP^Sc-Menge in den infizierten Zellen senken konnte.<br /> Die mithilfe der Biolumineszenzuntersuchung erhobenen Ergebnisse zeigten, dass das entwickelte und etablierte zellbasierte Testverfahren eine vielseitige Methode ist, um wichtige Aspekte der Prion Biologie zu erforschen.

Prion diseases like Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) are fatal neurodegenerative disorders that are triggered by misfolding of the cellular prion protein (PrP^C) to an infectious isoform rich in β-sheet structure termed PrP^Sc. There are evidence that PrP^C possibly forms dimers indicating that dimerization of PrP^C may be an essential intermediate step for the formation of PrP^Sc aggregates upon infection.<br /> To study PrP dimerization and PrP aggregation upon infection, a bimolecular complementation assay was developed using RK13 cells that lack endogenous PrP expression and stably expressed two fusion constructs between PrP and each half of split Gaussia luciferase. In these cells bioluminescence only occured when PrP dimerized or aggregated and the two split luciferase halves complemented each other.<br /> Using a panel of eight antibodies directed against different PrP domains, the central domain of PrP^C was identified to be critical for dimerization.<br /> Unlike normal brain homogenate infection of RK13 cells with brain homogenates from diseased animals containing six different mouse-adapted prion strains, RML, 22L, ME7, 87V, 79A, and 22A, lead to an increase in bioluminescence. In contrast, treatment of chronically infected but not uninfected RK13 cells with the anti-prion compound quinacrine reduced bioluminescence.<br /> Finally, a compound-screening with a compound library including 1650 bioactive compounds based on the bimolecular complementation assay identified JTC-801 as one compound that inhibited PrP^C-dimerization. Treatment of ScN2a cells with JTC-801 reduced PrP^Sc levels in these cells at nanomolar concentrations.<br /> Overall, these results showed that PrP^C clearly dimerizes in cells and that prion infection led to increased bioluminescence in the newly developed bimolecular complementation assay. The identification of JTC-801 as a bioactive compounds that inhibited PrP^C-dimerization and reduced PrP^Sc-levels in ScN2a cells at nanomolar concentrations suggested that PrP^C dimerization may be a critical step in the conversion process of PrPC to PrP^Sc.