Charakterisierung von gpr17 und dessen Einfluss auf die Myelinisierung im Zebrafisch (Danio rerio)
Charakterisierung von gpr17 und dessen Einfluss auf die Myelinisierung im Zebrafisch (Danio rerio)
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DissertationPrüfungsdatum
02.05.2018Datum der Veröffentlichung
05.06.2018Erstgutachter
Odermatt, BenjaminZweitgutachter
Kostenis, EviMetadaten
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Inhalt
Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein karpfenartiger Süßwasserfisch, der sich aufgrund seiner schnell voranschreitenden Embryogenese und der Transparenz der Embryonen bis zum 5. Tag nach der Befruchtung der Eizelle (5 dpf) als Modellorganismus in der Grundlagenforschung etabliert hat. Diese Eigenschaften ermöglichen beispielsweise auf visueller Ebene sowohl in vivo als auch in vitro die Verfolgung physiologischer Prozesse sowie die Untersuchung der Einflüsse gentechnischer Manipulationen oder pharmakologischer Agenzien. In der aktuellen medizinischen Forschung spielt die Aufklärung der komplexen Mechanismen der Myelinisierung, Remyelinisierung und Demyelinisierung von Nervenzellen eine wichtige Rolle, um neue Therapieansätze für bisher nicht heilbare demyelinisierende Erkrankungen, wie die Multiple Sklerose, entwickeln zu können. Die Myelinisierung von Axonen im zentralen Nervensystem wird sowohl bei Säugetieren als auch bei Fischen von myelinisierenden Oligodendrozyten übernommen. Der humane G-Protein-gekoppelte Rezeptor GPR17 wurde in der Membran von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen detektiert und spielt nachweislich eine wichtige Rolle bei der Differenzierung dieser Zellen zu myelinisierenden Oligodendrozyten in Säugetieren. Die detaillierten intrazellulären Signalwege von GPR17 sowie die Charakterisierung der Liganden sind jedoch noch nicht vollständig geklärt und werden kontrovers diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die beiden paralogen Gene gpr17a und gpr17b im Zebrafisch identifiziert. Die vorhergesagten Proteinstrukturen von Gpr17a und Gpr17b weisen die für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren charakteristischen sieben Transmembrandomänen sowie das konservierte H-X-X-R-Motiv in Transmembrandomäne 6 auf, welches beim humanen GPR17 für die Ligandenbindung verantwortlich ist. Mittels 5' RACE-PCR konnten zunächst die Exon-Intron Strukturen der genomischen Region von gpr17a und gpr17b aufgeklärt werden. Die Expressionsanalyse in den ersten 10 Tagen (dpf) zeigte für gpr17a einen drastischen Expressionsanstieg an Tag 3,5 (dpf) um das 11-fache, während das Expressionslevel anschließend tendenziell wieder abfiel. Das Expressionslevel von gpr17b war hingegen deutlich geringer, stieg bis zu Tag 6 (dpf) kontinuierlich an und viel anschließend wieder leicht ab. Weitere Untersuchungen zeigten, dass gpr17a und gpr17b im adulten Fisch ausschließlich im ZNS (Gehirn, Rückenmark und Auge) exprimiert werden. Mittels in situ Hybridisierung wurden für gpr17a neben der Expression im Kopfbereich drei weitere Expressionsbereiche detektiert: Ein Bereich oberhalb des Notochords in der Region der Bodenplatte, ein weiterer Bereich im Rückenmark dorsal der Bodenplatte sowie punktuell verteilte gpr17a-Signale auf der Ebene des Notochords. Bei der transienten Expression eines Plasmids, welches EGFP unter der Kontrolle des potentiellen gpr17a-Promotors exprimiert, wurden mittels 2-Photonenmikroskopie multipolare gpr17a-exprimierende Zellen im Bereich der Bodenplatte sowie dorsal des pMNs detektiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Gpr17a auf die Oligodendrogenese des Zebrafisches untersucht. In der transgenen Zebrafischlinie Tg(olig2:EGFP) führte der Knockdown von Gpr17a - verursacht durch einen gpr17a-Morpholino - zu einer signifikanten Reduktion dorsal migrierender olig2+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen verbunden mit einer signifikanten Reduktion der Expression der Myelin-assoziierten Gene mbpa und plp1b. In der transgenen Zebrafischlinie Tg(cldnk:GAL4,UAS:EGFP) bewirkte der Knockdown mittels gpr17a-Morpholino eine signifikante Reduktion der bipolaren cldnk+-Oligodendrozyten dorsal des pMNs. Diese Ergebnisse zeigen im Umkehrschluss, dass Gpr17a im Zebrafisch einen positiven Einfluss auf die Initiation der Differenzierung und Migration von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen hat und schließlich für die Bildung von bipolaren cldnk+-Oligodendrozyten benötigt wird. Mittels FACS-Analyse kombiniert mit RT-qPCR wurde schließlich die Expression von gpr17a in EGFP-exprimierenden olig2+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in drei Tage alten Zebrafischembryonen nachgewiesen. Co Lokalisationsstudien zeigten, dass die multipolaren gpr17a-exprimierenden Zellen sowohl im Bereich der Bodenplatte als auch dorsal des pMNs gleichzeitig olig2 exprimieren (frühe Oligodendrozyten-Vorläuferzellen), während die Expression von gpr17a in cldnk-exprimierenden Zellen (späte Oligodendrozyten Vorläuferzellen) nahezu ausgeschlossen wurde. Die Behandlung der Zebrafische mit Trichostatin A, einem Inhibitor der Oligodendrozyten-Entwicklung, führte zu einer signifikanten Reduktion der gpr17a-exprimierenden Zellen im Rückenmark verbunden mit einer nahezu vollständigen Abwesenheit der mbpa-Expression. Diese Ergebnisse deuten sehr stark auf die Expression von Gpr17a in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen des Zebrafisches hin. Weitere Untersuchungen dieser Arbeit gaben erste Hinweise darauf, dass Gpr17a im Zebrafisch ähnlich wie bei Säugetieren - auch in Neuronen und Olig2-exprimierenden Radialglia exprimiert wird und dass der GPR17-Agonist MDL29,951 auch im Zebrafisch den Gpr17a-Rezeptor beeinflusst. Die Charakterisierung von Gpr17a im Zebrafisch eröffnet neue Möglichkeiten den Einfluss von Gpr17a auf die Myelinisierung weiter untersuchen und verstehen zu können und diese im Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapieansätze für demyelinisierende Erkrankungen auf den Mensch übertragen zu können.
Schlagwörter
Gpr17, Zebrafisch, Myelinisierung
Klassifikation (DDC)
500 NaturwissenschaftenKleinert, Henning: Charakterisierung von gpr17 und dessen Einfluss auf die Myelinisierung im Zebrafisch (Danio rerio). - Bonn, 2018. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-50789
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-50789
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Die Myelinisierung von Axonen im zentralen Nervensystem wird sowohl bei Säugetieren als auch bei Fischen von myelinisierenden Oligodendrozyten übernommen. Der humane G-Protein-gekoppelte Rezeptor GPR17 wurde in der Membran von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen detektiert und spielt nachweislich eine wichtige Rolle bei der Differenzierung dieser Zellen zu myelinisierenden Oligodendrozyten in Säugetieren. Die detaillierten intrazellulären Signalwege von GPR17 sowie die Charakterisierung der Liganden sind jedoch noch nicht vollständig geklärt und werden kontrovers diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die beiden paralogen Gene gpr17a und gpr17b im Zebrafisch identifiziert. Die vorhergesagten Proteinstrukturen von Gpr17a und Gpr17b weisen die für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren charakteristischen sieben Transmembrandomänen sowie das konservierte H-X-X-R-Motiv in Transmembrandomäne 6 auf, welches beim humanen GPR17 für die Ligandenbindung verantwortlich ist. Mittels 5' RACE-PCR konnten zunächst die Exon-Intron Strukturen der genomischen Region von gpr17a und gpr17b aufgeklärt werden. Die Expressionsanalyse in den ersten 10 Tagen (dpf) zeigte für gpr17a einen drastischen Expressionsanstieg an Tag 3,5 (dpf) um das 11-fache, während das Expressionslevel anschließend tendenziell wieder abfiel. Das Expressionslevel von gpr17b war hingegen deutlich geringer, stieg bis zu Tag 6 (dpf) kontinuierlich an und viel anschließend wieder leicht ab. Weitere Untersuchungen zeigten, dass gpr17a und gpr17b im adulten Fisch ausschließlich im ZNS (Gehirn, Rückenmark und Auge) exprimiert werden. Mittels in situ Hybridisierung wurden für gpr17a neben der Expression im Kopfbereich drei weitere Expressionsbereiche detektiert: Ein Bereich oberhalb des Notochords in der Region der Bodenplatte, ein weiterer Bereich im Rückenmark dorsal der Bodenplatte sowie punktuell verteilte gpr17a-Signale auf der Ebene des Notochords. Bei der transienten Expression eines Plasmids, welches EGFP unter der Kontrolle des potentiellen gpr17a-Promotors exprimiert, wurden mittels 2-Photonenmikroskopie multipolare gpr17a-exprimierende Zellen im Bereich der Bodenplatte sowie dorsal des pMNs detektiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Gpr17a auf die Oligodendrogenese des Zebrafisches untersucht. In der transgenen Zebrafischlinie Tg(olig2:EGFP) führte der Knockdown von Gpr17a - verursacht durch einen gpr17a-Morpholino - zu einer signifikanten Reduktion dorsal migrierender olig2+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen verbunden mit einer signifikanten Reduktion der Expression der Myelin-assoziierten Gene mbpa und plp1b. In der transgenen Zebrafischlinie Tg(cldnk:GAL4,UAS:EGFP) bewirkte der Knockdown mittels gpr17a-Morpholino eine signifikante Reduktion der bipolaren cldnk+-Oligodendrozyten dorsal des pMNs. Diese Ergebnisse zeigen im Umkehrschluss, dass Gpr17a im Zebrafisch einen positiven Einfluss auf die Initiation der Differenzierung und Migration von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen hat und schließlich für die Bildung von bipolaren cldnk+-Oligodendrozyten benötigt wird. Mittels FACS-Analyse kombiniert mit RT-qPCR wurde schließlich die Expression von gpr17a in EGFP-exprimierenden olig2+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in drei Tage alten Zebrafischembryonen nachgewiesen. Co Lokalisationsstudien zeigten, dass die multipolaren gpr17a-exprimierenden Zellen sowohl im Bereich der Bodenplatte als auch dorsal des pMNs gleichzeitig olig2 exprimieren (frühe Oligodendrozyten-Vorläuferzellen), während die Expression von gpr17a in cldnk-exprimierenden Zellen (späte Oligodendrozyten Vorläuferzellen) nahezu ausgeschlossen wurde. Die Behandlung der Zebrafische mit Trichostatin A, einem Inhibitor der Oligodendrozyten-Entwicklung, führte zu einer signifikanten Reduktion der gpr17a-exprimierenden Zellen im Rückenmark verbunden mit einer nahezu vollständigen Abwesenheit der mbpa-Expression. Diese Ergebnisse deuten sehr stark auf die Expression von Gpr17a in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen des Zebrafisches hin. Weitere Untersuchungen dieser Arbeit gaben erste Hinweise darauf, dass Gpr17a im Zebrafisch ähnlich wie bei Säugetieren - auch in Neuronen und Olig2-exprimierenden Radialglia exprimiert wird und dass der GPR17-Agonist MDL29,951 auch im Zebrafisch den Gpr17a-Rezeptor beeinflusst. Die Charakterisierung von Gpr17a im Zebrafisch eröffnet neue Möglichkeiten den Einfluss von Gpr17a auf die Myelinisierung weiter untersuchen und verstehen zu können und diese im Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapieansätze für demyelinisierende Erkrankungen auf den Mensch übertragen zu können.},
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Die Myelinisierung von Axonen im zentralen Nervensystem wird sowohl bei Säugetieren als auch bei Fischen von myelinisierenden Oligodendrozyten übernommen. Der humane G-Protein-gekoppelte Rezeptor GPR17 wurde in der Membran von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen detektiert und spielt nachweislich eine wichtige Rolle bei der Differenzierung dieser Zellen zu myelinisierenden Oligodendrozyten in Säugetieren. Die detaillierten intrazellulären Signalwege von GPR17 sowie die Charakterisierung der Liganden sind jedoch noch nicht vollständig geklärt und werden kontrovers diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals die beiden paralogen Gene gpr17a und gpr17b im Zebrafisch identifiziert. Die vorhergesagten Proteinstrukturen von Gpr17a und Gpr17b weisen die für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren charakteristischen sieben Transmembrandomänen sowie das konservierte H-X-X-R-Motiv in Transmembrandomäne 6 auf, welches beim humanen GPR17 für die Ligandenbindung verantwortlich ist. Mittels 5' RACE-PCR konnten zunächst die Exon-Intron Strukturen der genomischen Region von gpr17a und gpr17b aufgeklärt werden. Die Expressionsanalyse in den ersten 10 Tagen (dpf) zeigte für gpr17a einen drastischen Expressionsanstieg an Tag 3,5 (dpf) um das 11-fache, während das Expressionslevel anschließend tendenziell wieder abfiel. Das Expressionslevel von gpr17b war hingegen deutlich geringer, stieg bis zu Tag 6 (dpf) kontinuierlich an und viel anschließend wieder leicht ab. Weitere Untersuchungen zeigten, dass gpr17a und gpr17b im adulten Fisch ausschließlich im ZNS (Gehirn, Rückenmark und Auge) exprimiert werden. Mittels in situ Hybridisierung wurden für gpr17a neben der Expression im Kopfbereich drei weitere Expressionsbereiche detektiert: Ein Bereich oberhalb des Notochords in der Region der Bodenplatte, ein weiterer Bereich im Rückenmark dorsal der Bodenplatte sowie punktuell verteilte gpr17a-Signale auf der Ebene des Notochords. Bei der transienten Expression eines Plasmids, welches EGFP unter der Kontrolle des potentiellen gpr17a-Promotors exprimiert, wurden mittels 2-Photonenmikroskopie multipolare gpr17a-exprimierende Zellen im Bereich der Bodenplatte sowie dorsal des pMNs detektiert. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Gpr17a auf die Oligodendrogenese des Zebrafisches untersucht. In der transgenen Zebrafischlinie Tg(olig2:EGFP) führte der Knockdown von Gpr17a - verursacht durch einen gpr17a-Morpholino - zu einer signifikanten Reduktion dorsal migrierender olig2+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen verbunden mit einer signifikanten Reduktion der Expression der Myelin-assoziierten Gene mbpa und plp1b. In der transgenen Zebrafischlinie Tg(cldnk:GAL4,UAS:EGFP) bewirkte der Knockdown mittels gpr17a-Morpholino eine signifikante Reduktion der bipolaren cldnk+-Oligodendrozyten dorsal des pMNs. Diese Ergebnisse zeigen im Umkehrschluss, dass Gpr17a im Zebrafisch einen positiven Einfluss auf die Initiation der Differenzierung und Migration von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen hat und schließlich für die Bildung von bipolaren cldnk+-Oligodendrozyten benötigt wird. Mittels FACS-Analyse kombiniert mit RT-qPCR wurde schließlich die Expression von gpr17a in EGFP-exprimierenden olig2+-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in drei Tage alten Zebrafischembryonen nachgewiesen. Co Lokalisationsstudien zeigten, dass die multipolaren gpr17a-exprimierenden Zellen sowohl im Bereich der Bodenplatte als auch dorsal des pMNs gleichzeitig olig2 exprimieren (frühe Oligodendrozyten-Vorläuferzellen), während die Expression von gpr17a in cldnk-exprimierenden Zellen (späte Oligodendrozyten Vorläuferzellen) nahezu ausgeschlossen wurde. Die Behandlung der Zebrafische mit Trichostatin A, einem Inhibitor der Oligodendrozyten-Entwicklung, führte zu einer signifikanten Reduktion der gpr17a-exprimierenden Zellen im Rückenmark verbunden mit einer nahezu vollständigen Abwesenheit der mbpa-Expression. Diese Ergebnisse deuten sehr stark auf die Expression von Gpr17a in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen des Zebrafisches hin. Weitere Untersuchungen dieser Arbeit gaben erste Hinweise darauf, dass Gpr17a im Zebrafisch ähnlich wie bei Säugetieren - auch in Neuronen und Olig2-exprimierenden Radialglia exprimiert wird und dass der GPR17-Agonist MDL29,951 auch im Zebrafisch den Gpr17a-Rezeptor beeinflusst. Die Charakterisierung von Gpr17a im Zebrafisch eröffnet neue Möglichkeiten den Einfluss von Gpr17a auf die Myelinisierung weiter untersuchen und verstehen zu können und diese im Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapieansätze für demyelinisierende Erkrankungen auf den Mensch übertragen zu können.},
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