Intranukleäre Mobilität und Export der kleinen Untereinheit in humanen Zellen

Abstract

Die Ribosomenbiogenese ist ein essentieller Prozess aller lebender Zellen, da ohne funktionale Ribosomen die Proteinsynthese in der Zelle zusammenbricht. Da der Prozess der Ribosomenbiogenese demnach so wichtig ist, wurde dieser bereits seit langem und detailliert untersucht. Dennoch blieb der Blick auf den Prozess ein statischer.<br /> In dieser Arbeit wurde erstmals die Biogenese auf Einzelmolekülebene<em> in vivo</em> durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Fluoreszenzmarkierung der in dieser Arbeit untersuchten kleinen Untereinheit <em>in vivo</em> gelang durch Dim2, einem Prozessierungsfaktor, der alle Vorläuferstufen der naszierenden Untereinheit begleitet. Dim2 wurde homolog als autofluoreszentes Fusionsprotein exprimiert, einmal mit eGFP, zum anderen mit einem Snap-Protein. Das Snap-Protein ist ein Derivat der O-6-Alkylguaninalkyltransferase und muss mit einem organischen Farbstoff gekoppelt werden. In dieser Arbeit wurde mit SiR-Snap gefärbt.<br /> Zur Expression beider Fusionsproteine wurden sowohl transiente als auch stabile Transfektionen durchgeführt. Die stabil überexprimierende Zelllinie zeigte einen hohen Anteil an ungebundenem Dim2, sodass für die weiteren Mobilitätsuntersuchungen eine mit Tetracylin induzierbare Zelllinie verwendet wurde.<br /> Durch FRAP- und Einzelmolekülexperimente konnte die intranukleäre Mobilität des Dim2 und der kleinen Untereinheit erfolgreich bestimmt werden. Die gefundenen Trajektorien wurden auf zwei verschiedene Arten analysiert. In beiden Analysen wurden drei Mobilitätskomponenten gefunden. Eine frei diffundierende Komponente mit einem Diffusionskoeffizienten von etwa D_f = 2,5 μm²/s, eine verlangsamte von etwa D_r = 0,3 μm²/s sowie eine immobile Komponente von etwa D_i = 0,05 μm²/s. In den beiden Kerndomänen Nukleolus und Nukleoplasma sind die drei Mobilitätskomponenten jedoch unterschiedlich stark vertreten. Während im Nukleolus die immobile Fraktion mit etwa 60 % den größten Anteil stellt und die mobile Fraktion mit etwa 7 % kaum vorhanden ist, sind im Nukleoplasma nur etwa 35 % der beobachteten Untereinheiten immobil.<br /> Außer der intranukleären Mobilität wurde zusätzlich der Exportprozess der Vorläuferuntereinheit aus dem Kern heraus verfolgt. Hierfür wurden zwei unterschiedliche Ansätze gewählt, um die Bewegung durch die Kernhülle visualisieren zu können. Einmal wurden Messungen auf Höhe des Zellkernäquators durchgeführt, die anderen Messungen auf dem Boden des Zellkerns. Damit waren Untereinheiten, die exportiert werden, einmal in horizontaler und einmal in vertikaler Bewegung zu beobachten. Es konnten allerdings nur einzelne Teilschritte des Exportprozesses abgebildet werden. Die ununterbrochene Beobachtung eines vollständigen Exportereignisses mit den Teilschritten Andocken - Transport - Loslösen gelang nicht.