Patientenspezifische induziert pluripotente Stammzellen als Modellsystem zur Untersuchung der lysosomalen Speichererkrankung Metachromatische Leukodystrophie

Abstract

Die Metachromatische Leukodystrophie (MLD) wird verursacht durch eine funktionelle Defizienz des metabolischen Enzyms Arylsulfatase A (ARSA). Unter physiologischen Bedingungen baut ARSA das Membranlipid 3'-O-Sulfo-Galaktosylceramid (Sulfatid) im Lysosom ab. In MLD-Patienten wird Sulfatid nicht degradiert und akkumuliert überwiegend in den myelinbildenden Zellen des Nervensystems, den Oligodendrozyten und Schwann-Zellen. Das führt zu einer Demyelinisierung und zu schwerwiegenden neurologischen Symptomen. Bislang sind die zugrunde liegenden Pathomechanismen unzureichend geklärt. Ein <em>in vitro</em>-Modell, welches den Phänotyp der Krankheit widerspiegelt, kann neue Erkenntnisse über die Krankheitsmechanismen liefern. Das neu entwickelte Verfahren, induziert pluripotente Stammzellen (<em>induced pluripotent stem cells,</em> iPSC) herzustellen, bietet die Möglichkeit, aus somatischen Zellen patientenspezifische Kultursysteme zu generieren. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden Hautfibroblasten von vier MLD-Patienten mit distinkten Mutationen im ARSA-Gen erfolgreich mit Hilfe von nicht-integrierenden Sendaiviren in iPSCs reprogrammiert. Anschließend wurden die vollständig validierten MLD-spezifischen iPSCs in radialgliaähnliche neurale Vorläuferzellen (<em>radial glia-like neural precursor cells</em>, RGL-NPC) differenziert. Diese sind multipotent und konnten nach Entzug der Wachstumsfaktoren in Astrozyten, Neurone und Oligodendrozyten differenziert werden. Eine ARSA-Enzymaktivitätsmessung bestätigte die funktionelle Defizienz des Enzyms in den MLD-RGL-NPCs sowie deren ausdifferenzierten neuralen Subtypen. In den untersuchten Differenzierungsstadien der MLD-abgeleiteten Oligodendrozyten konnten im Vergleich zu Kontrollzellen sowohl bei der Ablagerung von Sulfatid als auch in der Morphologie und im Differenzierungsverhalten der Zellen kein Unterschied festgestellt werden.<br /> Zusätzlich wurde in den ARSA-defizienten RGL-NPCs die Aufnahme von exogener ARSA studiert. Die Verabreichung von ARSA führte in den MLD-spezifischen Zellen zu einer Wiederherstellung der intrazellulären ARSA-Enzymaktivität. Die MLD-RGL-NPCs eignen sich somit als humanes neurales <em>in vitro</em>-Kultursystem, um die Mechanismen der ARSA-Aufnahme und die intrazelluläre ARSA-Aktivität zu studieren, sowie mögliche Wirkstoffe, die diese Prozesse beeinflussen können, zu evaluieren.<br /> Um die Funktionalität sowie mögliche Sulfatidakkumulationen und Myelinisierungsdefekte in den MLD-abgeleiteten Oligodendrozyten <em>in vivo</em> zu untersuchen, wurden die Zellen in ein krankheitsspezifisches Milieu eingebracht. Hierfür wurde ein Mausmodell generiert, welches die ARSA-Defizienz mit einer Myelin-Defizienz kombiniert. Mit Hilfe histologischer Analysen konnten prominente Sulfatidablagerungen besonders in den myelindefizienten faserreichen Strukturen des Gehirns demonstriert werden. Erste Transplantationsstudien in neonatale Mäuse zeigten, dass die RGL-NPCs für mindestens 8 Wochen überlebten, sich in das Empfängergewebe integrierten und in gliale Subtypen differenzierten. Die transplantierten Zellen waren in der Lage, MBP-positive Oligodendrozyten zu bilden. Dieses Xenotransplantat-Modell kann Aufschluss über mögliche oligodendrogliale Fehlfunktionen im Zusammenhang mit der ARSA-Defizienz und den Sulfatidablagerungen geben.